miRNA-7 and miRNA-324-5p regulate alpha9-Integrin expression and exert anti-oncogenic effects in rhabdomyosarcoma

miRNA-7和miRNA-324-5p调节α9-整合素在横纹肌肉瘤中的表达并发挥抗癌作用

期刊：Cancer Letters

影响因子：8.679

横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）是儿童期最常见的软组织肿瘤，占儿童肿瘤的6.5%左右。其临床表现多样，异质性强，预后与肿瘤原发部位、大小、压迫及侵犯周围组织、器官程度以及病理类型有关。原发部位以头颈部及泌尿生殖系统最常见，其次为四肢、躯干等其余部位。RMS对化疗、放疗敏感，但单一治疗效果差，需要肿瘤内、外科、放疗等多学科联合的综合治疗。

Integrin-整合素是介导细胞粘附到细胞外基质(ECM)的跨膜受体的主要家族。整合素可以产生双向信号(由内到外和由外到内的信号)，因为它们可以与ECM配体(如胶原蛋白或层粘连蛋白)和细胞对应受体相互作用，从而产生细胞内级联反应，主要是由接头蛋白如talin、信号分子如Src激酶和 FAK等介导。

Alpha9 integrin (ITGA9)在癌症进展和侵袭中起着特别重要的作用，是整合素家族中研究最少的成员之一，与β -1亚基形成异二聚，不依赖于RGD序列来识别配体，而大多数整合素都是如此。

MicroRNA (miRNA)是一种小的非编码RNA(长度≈22个核苷酸)，通过阻断mRNA翻译或诱导mRNA不稳定和随后的降解参与RNA沉默。此前，已在乳腺癌、肺癌和脑癌等的不同类型癌症中证实miR-7是一种潜在的肿瘤抑制因子，因为它能够调节许多已知的致癌基因，如表皮生长因子受体(EGFR)、FAK、p21激活激酶1 (PAK1)或细胞外信号调节激酶(ERK)。此外，最近的证据表明，miR-7能够调节肿瘤细胞和内皮细胞的迁移、侵袭和增殖，在肿瘤血管生成和转移中发挥关键作用。

miR-324-5p已被证明以一种癌症特异性的方式同时发挥致癌和抑制肿瘤的作用。虽然它抑制肝细胞癌细胞的侵袭，并在髓母细胞瘤和多发性骨髓瘤中发挥抑癌作用，但它也有助于结肠肿瘤的发生。

探索调控ITGA9的miRNA，寻求更有效的RMS治疗方案。

1、筛选调控ITGA9的miRNA

① 通过依赖计算机算法的方式筛选出ITGA9的13种候选miRNA；

② 检测在不同RMS细胞中ITGA9的表达，选出表达水平较高的RD和CW9019细胞做为后续机制研究实验载体；

③ 通过转染不同的候选miRNA，筛选出在两种细胞系中都具有显著干扰ITGA9表达的miRNA：miR-7和miR-324-5p

2、过表达miR-7和miR-324-5p降低RMS细胞的增殖和侵袭

① miR-7和miR-324-5p转染到RD和CW9019细胞中，鉴定到mRNA水平是显著升高； 

② 通过报告基因实验提示， miR-7和miR-324-5p均可结合到ITGA9 的3′UTR ，并抑制基因表达； 

③ miR-7和miR-324-5p均可抑制细胞增殖； lmiR-7抑制细胞侵袭。

3、过表达miR-7和miR-324-5p降低FAK及P-FAK水平

① WB检测在RD和CE9019细胞中过表达miR-7和miR-324-5p降低P-FAK水平； 

② 过表达miR-7 可以降低FAK 表达水平，miR-324-5p却无显著影响； lshRNA敲降ITGA9表达； 

③ ITGA9敲降组的细胞增殖和侵袭能力受到显著抑制侵袭；

4、稳定过表达miR-7可以持续降低ITGA9的表达，抑制细胞增殖和侵袭

① 通过dox诱导系统，进行诱导筛选miRNA稳定过表达细胞系；

② WB鉴定miRNA稳定过表达组中ITGA9的蛋白水平受到显著抑制；

① 两种miRNA均可抑制细胞增殖；

② 只有miR-7可以抑制细胞侵袭。

5、稳定过表达miR-7和miR-324-5p抑制移植瘤生长

① 采用过表达miRNA的RD细胞与对照细胞做原位移植瘤小鼠模型； 

② 在16周之后过表达组小鼠的肿瘤体积显著低于对照组； 

③ 过表达组小鼠肿瘤组织种ITGA9蛋白水平受到抑制； 

④ 肿瘤组织中细胞增殖marker Ki67及肿瘤血管Marker CD31阳性率低于对照组。

6、表达miR-7降低RMS细胞肺转移

① 在RD细胞中插入红色荧光蛋白RFP，将RFP+细胞通过尾静脉注射到小鼠体内； 

② 流式分析肺部组织匀浆中RFP+细胞； 

③ miR-7过表达组检测到的RFP+比例显著低于对照组。

    在本研究中，过表达miR-7和miR-324-5p抑制RMS细胞的增殖和转移，抑制ITGA9表达和FAK通路活化，是RMS治疗的潜在方式、方法。

创新点：

1.依赖计算机算法及细胞转染方法筛选出ITGA9的最佳调控miRNA；

2.这两种miRNA对RMS细胞的增殖和转移具有显著抑制作用。

不足：

1.没有阐明两种miRNA在调控细胞侵袭能力上效果不一致的分子机制，只在讨论中去推测miR7可能是调控FAK的转录影响细胞转移；

2.本文的研究只是增加了miR-7的一个靶基因-ITGA9，而它的其它靶基因FAK、PAK1、ERK都已经被证实，本文未能精确证实miR-7是通过抑制了ITGA9而发挥作用还是因为抑制其它关键分子通路发挥的调控作用。

可延伸点：

1.可以增加miR-7和miR-324-5p过表达组细胞的转录组测序，筛选出更多的靶基因，也可初步判断这两种miRNA对侵袭能力调控不一致的分子机制。

2.可以增加ITGA9 mut细胞，鉴定miR-7和miR-324-5p的过表达对细胞的增殖、侵袭能力是否还会有显著抑制作用，以判断ITGA9在这两个miRNA调控细胞增殖、侵袭中的作用强度。