Inhibiting Microglia-Derived NLRP3 Alleviates Subependymal Edema and Cognitive Dysfunction in Posthemorrhagic Hydrocephalus after Intracerebral Hemorrhage via AMPK/ Beclin-1 Pathway

通过 AMPK/Beclin-1 通路抑制小胶质细胞衍生的 NLRP3 可缓解脑出血后出血后室管膜下水肿和认知功能障碍

期刊名称    Oxid Med Cell Longev 

影响因子     7.310

发布时间     2022.5.17

对于出血后脑积水 （PHH） 患者，是否发生室管膜下水肿结果表明不佳，部分表现为认知障碍。在大脑中，主要来自小胶质细胞/巨噬细胞的NLRP3炎症小体参与出血后的促炎和神经衰竭，自噬对神经元稳态和功能至关重要。越来越多的证据表明，NLRP3炎症小体和自噬在脑出血（ICH）后起着至关重要的作用。本文旨在剖析室管膜下水肿形成和认知功能障碍的潜在机制。

在ICH-IVH的急性期，小胶质细胞/巨噬细胞的NLRP3炎性小体的表达和神经元的自噬都上调。小胶质细胞/巨噬细胞中激活的NLRP3促进了IL-1β向细胞外的释放，这导致了过度的自噬，导致神经元通过AMPK / Beclin-1途径结合转录组学在体内和体外凋亡。ICH-IVH后给予MCC950（NLRP3炎症小体特异性抑制剂）可显着减少水肿形成并改善认知功能障碍。

因此，抑制SVZ中的NLRP3激活可能是PHH患者的一种有前途的治疗策略，需要进一步研究。

探讨ICH-IVH后室管膜下水肿形成相关认知功能障碍的机制。

1、抑制NLRP3可减轻神经功能缺陷，尤其是ICH-IVH的认知功能障碍。

2、抑制NLRP3炎症小体减少ICH-IVH后室管膜下水肿。

3、MCC950抑制小胶质细胞/巨噬细胞衍生的NLRP3炎症小体在SVZ中的活化。

4、NLRP3抑制防止SVZ中ICH-IVH后神经元过度自噬介导的细胞凋亡。

5、NLRP3上调神经元自噬通过AMPK/Beclin-1通路结合转录组学。

6、IL-1β加速到神经元 PC12细胞中过度自噬和凋亡。

1、抑制NLRP3可减轻神经功能缺陷，尤其是ICH-IVH的认知功能障碍

旷场实验（测试焦虑）

根据先前的研究，ICH-IVH大鼠表现出严重的运动功能障碍。为了确定NLRP3炎症小体抑制剂MCC950是否影响ICH-IVH大鼠的认知功能，通过旷场实验和ICH-IVH后第3天的水迷宫测试评估认知功能。

与假手术组相比，ICH-IVH大鼠有明显的认知功能障碍，根据旷场实验结果，运动活动减少，MCC950治疗组减少了出血后的认知和运动功能障碍。

ICH-IVH后的空间和识别记忆以及自发运动行为评估，并用MCC950抑制NLRP3炎症小体。

使用水迷宫测试进一步评估认知功能，在训练阶段没有小组差异来寻找隐藏的平台（e图）。

在空间记忆探针试验期间具有代表性的游泳路径，表明与ICH-IVH大鼠相比，接受MCC950处理的ICH-IVH大鼠在前平台位置上进行了更多的交叉（d图）。

并且在目标象限中花费了更多的游泳时间（f图），表明空间记忆障碍得到改善，评估认知功能的结果与旷场测试相同。至于运动功能障碍，转角测试用于评估脑出血后的不对称性行为学测试，结果显示抑制NLRP3改善了脑出血后的运动缺陷（g图）。

这些发现表明MCC950给药可以改善脑出血后NLRP3炎症小体依赖性神经功能障碍，特别是空间记忆缺陷。

2、抑制NLRP3炎症小体减少ICH-IVH后室管膜下水肿

（a）T2加权图像和伪彩色图像显示不同组3天时室管膜下水肿。

（b）各种治疗后大脑不同部位的脑含水量。

（c） 根据MRI图像对脑室下区脑水肿体积进行定量分析。

（d）脑室下区组织的HE染色图像显示水肿和毛细血管状况（上）所有3组毛细血管的透射电镜图像（下）。

（e） 在毛细血管中表达的 ZO-1 的代表性图像 （CD31）。

（f） 蛋白质印迹图像和分析结果显示不同组的ZO-1在SVZ（脑室下区）中的表达。

ICH-IVH 介导的脑积水和 MCC950 治疗后的室管膜下水肿评估。脑积水后发生的水肿完全是非血管源性水肿，NLRP3的抑制降低了SVZ的水肿。

3、MCC950抑制小胶质细胞/巨噬细胞衍生的NLRP3炎症小体在SVZ中的活化

NLRP3炎小体和相关的细胞因子表达在SVZ中ICH-IVH和MCC950治疗后小胶质细胞/巨噬细胞。

  (a） SVZ中IL-1β和半胱天冬酶-1阳性细胞的代表性图像。

（b） SVZ 中 IL-1β 和半胱天冬酶-1 阳性细胞的统计结果。

（c） SVZ中Iba1和CD68阳性细胞上表达的NLRP3的双重免疫荧光染色的照片。（d） SVZ 中 NLRP3 阳性小胶质细胞/巨噬细胞的计数结果。

e）蛋白质印迹图像和分析结果显示，MCC950治疗后3天NLRP3、半胱天冬酶-1和IL-1β的表达情况。

NLRP3炎性小体在小胶质细胞/巨噬细胞中激活并释放细胞因子可能是SVZ中ICH-IVH后导致脑水肿的原因。

4、NLRP3抑制防止SVZ中ICH-IVH后神经元过度自噬介导的细胞凋亡

自噬通量变化介导的神经元在SVZ中ICH-IVH和MCC950治疗后退化和凋亡。

（a） SVZ中Atg5和p62阳性神经元的代表性免疫荧光染色图像。

（b）蛋白质印迹图像和分析结果显示自噬蛋白Atg5，LC3B和p62在接受MCC950或盐水的ICH-IVH大鼠的SVZ中表达。

（c）ICH-IVH和MCC950治疗后SVZ神经元的FJC染色和TUNEL染色图像

（d）ICH-IVH和MCC950治疗后SVZ神经元的FJC染色和TUNEL分析结果

（e）位于SVZ的神经元的TEM图像显示微观结构和水肿。

基于这些结果，证明抑制小胶质细胞/巨噬细胞中NLRP3炎症小体表达可以减少脑水肿并下调神经元自噬以保护SVZ的神经功能。

5、NLRP3上调神经元自噬通过AMPK/Beclin-1通路结合转录组学

SVZ组织的转录分析确定AMPK / ULK1 / Beclin-1是小胶质细胞/巨噬细胞衍生的NLRP3炎症小体和神经元过度自噬介导的ICH-IVH后凋亡的潜在途径。

（a）火山样图显示ICH-IVH和MCC950处理后第3天SVZ存在差异表达基因

（b） PCA为假组和ICH-IVH组之间的每个样品鉴定的明显不同的表达基因的热图。

（c）热图显示，ICH-IVH处理后MCC950处理或未有明显不同的表达基因。数据在GENE中分层聚类，并根据行最小值和最大值着色。

（d） AMPK/ULK1/Beclin-1 通路的代表性蛋白质印迹图像和定量分析结果。

基于上述结果，推测NLRP3炎症小体可能通过AMPK / Beclin-1途径介导神经元凋亡，AMPK / Beclin-1途径也可以调节自噬。此外，转录组测序结果也支持之前的结论。

6、IL-1β加速到神经元 PC12细胞中过度自噬和凋亡

IL-1β上调神经元自噬和凋亡，抑制自噬可以减少IL-β介导的神经元凋亡，IL-β在NLRP3激活后释放。

（a）Atg5和p62阳性PC12细胞的代表性免疫荧光染色图像。

（b） PC12 细胞的免疫荧光 TUNEL 染色图像，以及不同处理后 TUNEL（+） 细胞的统计结果。

（c）PC12细胞中LC3B和p62表达的代表性蛋白质印迹图像，以及IL-1β和化合物C处理后LC3B-II：LC3B-I比值和p62的统计结果。

（d）流式细胞术的代表性图像和统计结果显示，IL-1β和化合物C处理后的早期/晚期凋亡细胞。

本研究表明，小胶质细胞/巨噬细胞中NLRP3炎性小体活化加重了SVZ中ICH-IVH后水肿形成和神经元凋亡，并且通过AMPK / Beclin-1信号通路上调自噬介导神经元凋亡,NLRP3相关的细胞外细胞因子IL-1β有助于这一过程。

因此，抑制NLRP3激活可能是一种潜在的治疗策略，可以减少室管膜下水肿，以改善出血后脑积水患者管理中的认知功能。

局限性：

局限一：NLRP3在炎症反应中起多功能作用，NLRP3炎性小体在多种神经细胞中被激活。需要进一步研究NLRP3抑制在ICH-IVH后继发性脑损伤中的神经保护作用的其他机制。

局限二：由于NLRP3不仅像我们的免疫荧光染色所显示的那样在小胶质细胞/巨噬细胞上表达，有必要进一步研究NLRP3在其他中枢神经系统（CNS）细胞（如星形胶质细胞）中的作用。

局限三：我们发现NLRP3激活可以调节室管膜下水肿的形成，但NLRP3介导细胞的特定机制，以及非血管源性间质性水肿仍有待研究。

局限四：应更深入地评估神经元自噬在出血后如何影响神经元功能以及与NLRP3相关的相关机制。    

最近的研究和我们目前的研究已经证明了使用MCC950抑制NLRP3表达的有效性。但是，MCC950的作用时间和稳定性非常有限。本研究仅关注ICH-IVH后SVZ的早期病理生理学变化（3天），进一步研究需要更长的时间研究。同时，NLRP3对特定细胞类型的影响需要更精确的基因编辑技术。