类器官中的基因表达往往具有明显空间差异。qPCR可以检测整体RNA变化，整装原位杂交（Whole-mount in situ hybridization，WISH）则直接在完整类器官中显示目标RNA的位置，同时保留三维形态和区域结构。
经典显色型WISH常采用DIG标记RNA探针＋抗DIG-AP抗体＋NBT/BCIP显色。整个实验通常持续3～4天，主线可以概括为：
固定 → 甲醇处理 → 通透 → 预杂交 → 探针杂交 → 洗涤 → 抗体孵育 → 显色。
以下参数可作为完整类器官DIG-WISH的起始条件，再根据类器官大小和探针情况调整。
提前制备DIG标记的antisense RNA探针，并确认探针完整性。探针序列尽量选择目标转录本特异区域；涉及多个剪接异构体时，提前确认探针识别范围。
同时准备4% PFA、PBST、甲醇梯度液、Proteinase K、预杂交/杂交液、SSC/SSCT、封闭液、抗DIG-AP抗体、NTMT和NBT/BCIP。
一套可参考的杂交液包括：5× SSC、50 mM DTT、1 mM EDTA、1× Denhardt's solution、100 μg/mL tRNA、50% formamide和0.1% Tween。
探针制备、样本处理和杂交阶段保持RNase-free操作。
类器官达到实验终点后完整回收。基质胶培养的样本先轻柔去除残留基质，再用PBS清洗。
加入4% PFA，室温固定20～30 min，随后PBST清洗。换液时保持动作轻柔，带腔体或出芽结构的类器官尽量让样本自然沉降后再吸取上清。
固定后的类器官依次进入：25%甲醇 → 50%甲醇 → 75%甲醇 → 100%甲醇。
完成100%甲醇处理后，可以继续实验，也可以在这一阶段保存样本，后续统一进行杂交。
杂交当天按照：75%甲醇 → 50%甲醇 → 25%甲醇 → PBST 逐级重新水化。
随后加入Proteinase K，5 μg/mL、室温约2 min可作为起始条件。处理后立即PBST清洗，再用4% PFA固定10 min。
Proteinase K处理时间需要结合类器官尺寸调整。体积较大、结构致密的样本可适当增加时间，小型类器官则从较短时间开始。
加入预热的杂交液，65℃孵育约2 h。
预杂交期间同步准备探针杂交液和样本编号，后续直接进入过夜杂交。
将预杂交液更换为含DIG标记antisense RNA探针的杂交液。
完整类器官可从每份样本约0.5 μg RNA探针开始摸条件，65℃杂交过夜。
第二天依次进行：
预杂交液∶2× SSC＝1∶1，65℃ 15 min；
2× SSCT，65℃洗3次，每次15 min；
PBST室温洗2次。充分洗去游离探针后进入抗体检测。
使用PBST＋5% normal goat serum室温封闭约2 h。
随后加入抗DIG-AP抗体，1∶2000可作为起始稀释条件，4℃孵育过夜。
第二天先用PBST清洗3次，再用NTMT清洗2次。
加入NBT/BCIP后观察显色进程。
目标区域形成清晰紫蓝色沉淀、背景保持干净时结束反应。
第一批实验记录信号出现和达到合适强度的大致时间。后续同批实验尽量保持接近的显色时长。显色结束后用PBST清洗，再用4% PFA固定保存并拍照。
图2｜完整类器官SHH mRNA原位杂交结果
整套实验大致可以这样安排：
全程正常处理，仅省去RNA探针，用于判断抗体和显色体系产生的背景。
使用对应sense RNA探针。实验组出现明确空间信号、sense组保持低背景，可以进一步支持探针特异性。
选择在当前类器官模型中稳定表达的基因，验证RNA保存、通透、杂交和显色体系是否正常。
条件允许时，可加入敲除样本或明确缺乏目标表达的类器官，进一步判断探针特异性。
建立新体系时，优先把Proteinase K处理时间、探针浓度和显色窗口做成小梯度。这三个参数稳定下来，后续重复性通常会明显提高。
研究转录调控时，可以按照：qPCR观察整体RNA变化 → WISH观察RNA空间位置 → 整装IF观察蛋白分布，来逐步补充空间信息。
类器官WISH可以直接记住这一条实验线：
收样固定 → 甲醇处理 → Proteinase K通透 → 预杂交 → 探针过夜杂交 → 高严格度洗涤 → 抗DIG孵育 → NBT/BCIP显色。
前期把类器官处理好，中间让探针充分进入，最后把背景洗干净。再配合合适的阴性和阳性对照，一套完整的WISH结果就比较清楚了。
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