T 细胞体外杀伤实验是肿瘤免疫研究中评价效应细胞功能的核心实验，广泛应用于抗原特异性 T 细胞功能验证、CAR-T 细胞活性检测、免疫药效筛选等场景。

对于新手而言，细胞状态不均一、效靶比选择不当、检测方法选错都容易导致实验结果波动大、重复性差。

本文整理了标准化操作流程、三种主流检测方法的详细步骤与结果计算，以及高频问题避坑指南，文中参数可作为起始条件，正式实验前需结合具体细胞和检测体系优化。

将具有细胞毒活性的效应 T 细胞与靶细胞按特定比例共同孵育，效应细胞通过释放穿孔素、颗粒酶等介质诱导靶细胞死亡。通过定量检测靶细胞的死亡比例，即可反映效应 T 细胞的杀伤活性。进行抗原特异性 T 细胞、TCR-T 或 CAR-T 实验时，还需保证效应细胞与靶细胞之间具有明确的抗原识别关系。

图 1丨T 细胞杀伤靶细胞的分子机制

（一）试剂与仪器

1.试剂：

完全培养基（RPMI 1640+10% 胎牛血清 + 双抗）、PBS 缓冲液、CD3 抗体、CD28 抗体、LDH 细胞毒性检测试剂盒、CCK-8 试剂盒、CFSE 或 CellTrace 细胞追踪染料、PI 染液、LDH 试剂盒配套裂解液。

2.仪器：

二氧化碳培养箱、超净工作台、低速离心机、酶标仪、流式细胞仪、96 孔细胞培养板。

（二）细胞准备

1.效应 T 细胞

可采用原代分离的 CD8+ T 细胞，或抗原特异性 T 细胞系、TCR-T、CAR-T 细胞。

原代 T 细胞需提前活化：采用包被法，将 CD3 抗体（1-5 μg/mL）加入培养板，4℃包被过夜，弃液后 PBS 洗涤 1 次，加入 CD8+ T 细胞悬液，同时加入可溶性 CD28 抗体（1-2 μg/mL），置于 37℃、5% CO₂ 培养箱活化 2-3 天。活化后计数并检测活率，细胞状态良好即可用于实验。

2.靶细胞

选择与效应 T 细胞识别机制相匹配的肿瘤细胞系，提前 2-3 天传代，保证实验时处于对数生长期，细胞活率≥95%。贴壁细胞需提前消化计数，悬浮细胞直接离心计数即可。CAR-T 实验建议设置靶抗原阴性细胞作为对照。

图 2 丨T 细胞体外杀伤实验完整操作流程

（一）效应细胞制备

收集活化后的效应 T 细胞，300×g 离心 5 min，弃上清，用完全培养基重悬计数，调整细胞浓度至合适梯度备用。可提前根据预实验的效靶比范围，配制 2-3 个浓度梯度的细胞悬液。

（二）靶细胞制备

根据所选检测方法，对靶细胞进行对应处理：

1.LDH 释放法

将靶细胞调整浓度至 1×10⁵ 个/mL，接种至 96 孔板，每孔 100 μL。贴壁细胞需提前 4-6 小时接种，待细胞完全贴壁后再加入效应细胞。实验板需同时设置对照组：靶细胞自发释放孔、效应细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔和空白孔，每组设置 3 个复孔。

图 3丨LDH 释放法检测原理

2.CFSE/CellTrace + PI 流式检测法

取适量靶细胞，用 PBS 重悬后加入 CFSE 或 CellTrace 细胞追踪染料，按照说明书设置标记浓度，37℃避光孵育 10-15 min。孵育结束后加入完全培养基终止标记，300×g 离心 5 min，完全培养基洗涤 2 次，调整细胞浓度至 1×10⁵ 个/mL 备用。

图 4丨不同效靶比下 T 细胞杀伤活性流式结果

3.CCK-8 法

将靶细胞调整浓度至 5×10⁴ 个/mL，接种至 96 孔板，每孔 100 μL。贴壁细胞提前过夜接种，保证细胞贴壁牢固且处于对数生长期。同样设置靶细胞单独孔、对应数量的效应细胞单独孔和空白孔作为对照。

图 5丨CCK-8 法细胞活性检测原理

（三）效靶共培养

向靶细胞孔中加入效应 T 细胞悬液，按预设效靶比调整每孔总体积至 200 μL。

常用效靶比梯度为 20:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1。轻轻晃动培养板混匀，置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中孵育。短时杀伤实验常孵育 4-6 小时；若延长至 16-24 小时，应结合检测方法、靶细胞自发死亡和增殖情况重新优化，LDH 法尤其需根据试剂盒和预实验确定时间。

（四）检测与结果计算

1.LDH 释放法

孵育结束前约 45 分钟，向最大释放孔中加入配套裂解液。孵育结束后，吸取各孔上清液至新的 96 孔板，按照试剂盒说明书加入底物工作液，反应后加入终止液，并在规定波长处检测吸光度。

杀伤率（%）=［实验组 OD 值－效应细胞自发释放 OD 值－靶细胞自发释放 OD 值］/［靶细胞最大释放 OD 值－靶细胞自发释放 OD 值］×100%

2.流式检测法

孵育结束后，将各孔细胞收集，PBS 洗涤 1 次。加入 PI 染液，终浓度 1-2 μg/mL，冰上避光孵育 5 分钟。流式细胞仪检测，圈出 CFSE/CellTrace 阳性的靶细胞群，统计其中 PI 阳性细胞比例。

特异性杀伤率（%）=［实验组靶细胞死亡率－靶细胞自发死亡率］/［100－靶细胞自发死亡率］×100%

3.CCK-8 法

孵育结束后，每孔加入 20 μL CCK-8 试剂，轻轻混匀避免产生气泡。放回培养箱继续孵育 1-4 小时，用酶标仪在 450 nm 波长处检测吸光度。

杀伤率（%）=［1－（实验组 OD 值－效应细胞单独孔 OD 值）/（靶细胞单独孔 OD 值－空白孔 OD 值）］×100%

CCK-8 检测的是共培养体系整体代谢活性，不能直接区分效应细胞和靶细胞信号，更适合快速预实验和初步比较。

1.LDH 释放法

无需标记细胞，操作简便，可高通量检测，适合大量样本初筛；缺点是效应细胞和靶细胞均存在自发 LDH 释放，需要设置完整对照，适用于高通量药效初筛、大量样本的活性比较。

2.流式检测法

可区分靶细胞和效应细胞，并直接定量靶细胞死亡比例，结果准确，重复性好；缺点是需要流式细胞仪，操作步骤相对多，检测通量中等，适用于精准定量杀伤活性、抗原特异性 T 细胞功能验证。

3.CCK-8 法

操作最简单，试剂单一，对细胞损伤小；缺点是检测整体代谢活性，无法直接区分靶细胞和效应细胞信号，特异性较差，适用于快速预实验、细胞毒性初步检测。

第一，靶细胞状态是实验核心

靶细胞必须处于对数生长期，密度过高、传代次数过多都会导致自发死亡升高，背景值偏大。建议实验前一天传代，保证实验时细胞活率在 95% 以上。

第二，效靶比不要盲目照搬文献

不同 T 细胞活化程度、不同靶细胞系的敏感性差异极大，建议正式实验前先做 2-3 个梯度的预实验，找到信号清晰的比例范围。

第三，LDH 实验注意背景值

效应细胞、靶细胞及培养体系均可能产生背景信号，建议设置完整的空白、自发释放和最大释放对照。若背景过高，应结合试剂盒要求优化培养条件。

第四，荧光标记注意事项

CFSE 或 CellTrace 标记后必须充分洗涤，残留游离染料会导致背景荧光升高。染料浓度过高还可能影响细胞状态，首次使用时建议先优化标记浓度和时间。

第五，最大释放组验证

LDH 实验的最大释放孔必须确保靶细胞完全裂解，应按照所用试剂盒要求加入配套裂解液并充分混匀。裂解不完全会导致计算出的杀伤率偏高。

T 细胞体外杀伤实验的稳定性，核心在于细胞状态的均一性和对照体系的严谨性。建议新手从 LDH 法入门，积累经验后再根据研究需求选择更精准的检测方法。正式实验前开展小范围预实验，优化效靶比和孵育时间，能明显提升实验成功率和结果重复性。