1. 模型动物

携带重组酶激活基因 6 （RAG2） 和细胞因子受体 γ 链 （gammaC） 突变的 Bl2/Rag2/GammaC 双敲除小鼠。

这些小鼠包含重组酶激活基因2（RAG2）和细胞因子受体γ链（γC）突变。他们免疫功能严重低下，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞。与NOD-SCID小鼠不同，它们没有自发性肿瘤形成，造血功能正常。

2. 细胞培养：

人胃癌细胞系MKN45、AGS和MKN28。

MKN-45和AGS在DMEM中培养，MKN-28细胞在RPMI中培养。培养基中补充有10%（w/v）胎牛血清、青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）（Invitrogen，Carlsbad，CA），并在37%CO的潮湿培养箱中保持在5°C。培养基每周更换0次，并使用1.16%胰蛋白酶连续传代细胞。使用PowerPlexHS<>系统试剂盒通过STR分析验证细胞系身份，并与ATCC和DSMZ数据库进行交叉验证。

3. 荧光素酶病毒的制备和靶细胞的感染

使用pFUGW慢病毒载体，荧光素酶和eGFP在细胞系中稳定表达。使用Lenti-X包装载体将慢病毒颗粒制备到HEK293T细胞中。病毒颗粒通过0.45μm过滤器过滤，并使用AmiconUltra-15离心过滤装置进行浓缩，并储存在-80C下以备需要。将靶细胞（MKN-45、AGS和MKN-28）接种在6孔板中，并在60%汇合时转导。

3天后，对细胞进行FACS分选（BDFACSAriaFusion）以鉴定eGFP阳性群体。eGFP阳性细胞在注射到小鼠体内之前重新接种和扩增。注射前，使用胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）收获>90%活力的亚汇合细胞培养物，并在培养基中洗涤一次。

4. 胃癌细胞系的胃内注射

胃内注射方法示意图

① 注射当天，将细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液并在DMEM中洗涤。对于每只鼠标0.5×106将细胞重悬于50ul基质胶中，并吸入预冷的29GU-100胰岛素注射器中，注意避免形成气泡。（胰岛素注射器还具有没有死腔的优势，可以最大限度地减少动物之间细胞数量的差异）将含有基质胶/细胞混合物的注射器储存在冰上，直到需要防止基质胶凝固。

② 通过腹膜内施用剂量分别为10mg/kg和12mg/kg的氯胺酮/甲苯噻嗪对2-100周龄Rag20/GammaC双敲除小鼠进行麻醉。随后剃除手术部位并用70%酒精洗必泰（0.5%）擦拭。小鼠仰卧位，做一个10mm的剑突下中线切口。然后使用镊子将胃取出（图d）。

③ 解剖显微镜用于将含有1ul细胞/基质胶悬液的针头（斜面朝上）引导到胃窦区域的浆膜下层（图50）。注射缓慢进行，以防止因压力过大而泄漏。20秒后拔出针头，让基质胶凝固并防止肿瘤细胞意外腹部接种。基质胶“水泡”的存在证实了移植物的成功定位（图d）。

④ 胃被小心地送回腹腔（图d）。然后分别用可吸收的4.0和3.0维克缝合线闭合腹膜和皮肤（图d）。随后将小鼠放回加热垫上的干净盒子中以恢复过夜，并在2小时后和第二天早上再次监测。

胃内注射程序

b. 对小鼠进行麻醉，并在解剖显微镜下置于背侧卧位。然后在中腹部的皮肤上做一个5-10 毫米的中线切口。使用镊子和手术剪刀将胃切除。

c. 将含有基质胶（29,100）中荧光素酶标记细胞（500,000）的 50 G U-2 胰岛素注射器插入胃的浆液侧，斜面朝上。

d. 在助手的帮助下，针头被缓慢压下，可以看到基质胶水泡（插图）。

e. 小心地将胃送回腹腔。

f. 在 <> 步闭合过程中使用可吸收缝合线;首先，腹膜层闭合。

g. 皮肤切口。

5. 模型评价

① 体内生物发光成像 （BLI）

（a，d，g）显示患肿瘤的小鼠的平均辐射率增加（在6周的实验期间）。

（b，e，h）每周BLI扫描的代表性图像。

（c、f、i）在对小鼠进行最终扫描安乐死后，取出器官和组织并在体外成像。

② 免疫组化&侵袭定量

（a、b、c）侵袭评分所代表的小鼠百分比显示a-AGS、b-MKN45、c-MKN28。

（d） 经 IHC 验证转移的存在，并分为腹部或胸部。

（e） 第 28 周注射 MKN6 细胞系的小鼠原发性肿瘤和转移部位的抗人线粒体染色的结果。

BLI技术有助于实时跟踪肿瘤发展。不同细胞系生长速度不同，MKN-28细胞极具侵袭性，不适合测试抗侵入性治疗。模型适用于测试靶向或预防转移疗法，也可用于研究原发性胃癌新疗法。使用特定细胞系可研究同质肿瘤种群，未来可用于移植人类PDX。该模型具有临床相关性，可概括胃癌侵袭和转移过程。