肺类器官作为先进的三维(3D)细胞培养模型，在探索人类肺部发育机制及呼吸道疾病的研究中发挥着关键作用。这些疾病涵盖广泛，如SARS-CoV、H1N1、MERS等病毒感染，囊性纤维化、哮喘/慢性阻塞性肺疾病(COPD)，以及空气污染和吸烟对健康的影响。与传统方法如使用永生化肺细胞系或原代细胞相比，肺类器官的优势在于其包含了多种分化的细胞类型，并模拟了体内复杂的组织结构，从而提供了更为接近真实生理环境的模型。
肺类器官能从有限的患者组织样本或多能干细胞中衍生出来，这为个性化生物医学研究建立了宝贵的活体生物库。其中，3dGRO™人肺类器官培养系统是一个高效、无血清且多阶段的方案，它能够将人诱导多能干细胞(iPS)成功分化为成熟的肺类器官，这些类器官的结构与体内的分支气道和早期肺泡结构高度相似。
通过3dGRO™系统生成的肺类器官不仅数量可观，而且表达了多种标志物，这些标志物是成熟肺和气道中各种细胞类型的特征，例如II型肺泡上皮(ATII)细胞中的SFTPB和SFTPC（表面活性物质相关蛋白B和C），气道杯状细胞中的MUC5AC，以及肺内胚层标记EpCAM、Sox9和Nkx2.1，纤毛细胞中的乙酰-α-微管蛋白，还有间充质标记波形纤维蛋白。
此外，肺类器官还具备表达血管紧张素转换酶2 (ACE2) 和TMPRSS2的能力，这两种分子分别作为SARS-CoV-2病毒（导致COVID-19的病原体）的受体和辅助其入侵的丝氨酸蛋白酶，使得肺类器官成为研究新型冠状病毒及其感染机制的重要工具。综上所述，肺类器官及其培养系统为研究肺部生理、病理过程以及开发针对呼吸道疾病的新疗法提供了强有力的支持。
人肺类器官分化实验流程
使用诱导培养基(SCM302)在4天内将人多能干细胞分化成定型内胚层细胞。在第4-8天，诱导培养基 (SCM305、SCM306) 将人定型内胚层细胞分化为前肠内胚层 (AFE)。AFE细胞可以冷冻保存 (商业化产品货号SCC301) 或使用 3dGRO™ 肺类器官分支培养基 (SCM307) 进一步分化成分支肺芽型类器官，并使用 3dGRO™ 肺类器官成熟培养基 (SCM308) 进一步成熟为分支型和肺泡型类器官。
1. 人 iPS 细胞分化为定型内胚层（ 0-4 Day）
注意：从高品质未分化的人 ES/iPS 细胞 (SCC271) 开始，这些细胞汇合度约为 70-80%，且含有 <5% 的分化细胞。以下方案用于六孔组织培养处理板中的一孔。指示的体积针对单孔。请根据需要调整用量。
2. DE 细胞分化为前肠内胚层细胞（4-8 Day）
注意：在定型内胚层细胞的第 4 天和分化为前肠内胚层 (AFE) 细胞后的第 8 天，应观察到较高细胞密度。下面的方案提供了 6 孔板型的参考接种密度。其他板型的接种密度需做调整。
类器官处于悬浮培养中，根据方案进行培养基更换：
① 使用1mL玻璃血清移液器将漂浮的类器官转移到无菌的15mL锥形管中。等待10分钟，使类器官沉淀到试管底部。
② 将2mL吸液管连接真空泵。在2mL吸气移液器上，连接一个无菌的20μL非屏障移液器枪头。小心地吸出培养基。注意在类器官上方留下少量培养基作为缓冲液，以避免干扰类器官。
③ 将0.5mL3dGRO™肺类器官分支培养基(SCM307)添加到含有类器官沉淀的15mL管中。用1mL玻璃移液器上下吹打两次。将类器官转移回超低附着24孔板中的同一孔中。
④ 将0.5mL3dGRO™肺类器官分支培养基(SCM307)添加到15mL锥形管中，冲洗并收集所有剩余的类器官。将冲洗液添加到超低附着24孔板的同一孔中。总体积=每孔1mL。
4. 将肺芽类器官 (LBO) 分化为成熟的肺类器官（ 25-60Day ）
悬浮培养的人肺芽类器官（LBO）
分化第23天未成熟人iPS细胞衍生LBO的形态学
注意：培养至20-25 天，会有许多漂浮的肺类器官。每个 ECM基质胶 包埋夹层应包含大约 4-6 个类器官。根据您计划制作的 ECM基质胶包埋夹层的数量，计算96 孔板中制备类器官/ECM基质胶悬浮液所需的孔总数。
1. 肺类器官成熟的时间过程
在两个单独的孔中追踪人iPS 细胞衍生的肺类器官分化
在第20至25天的时间窗口内，选取大约4至6个未成熟的肺芽（LBO），并将它们嵌入到细胞外基质（ECM）基质胶中。采用3dGRO™肺类器官成熟培养基来支持这些肺类器官的发育。
在培养过程中，观察到多种形态变化。其中，一些肺类器官在顶端区域形成了分支结构，这些结构可能代表了肺部的气道系统。同时，还有一些肺类器官呈现出圆形扩张的形态，其中心区域则发育出了类似于肺泡球的致密组织，这可能与肺部的气体交换功能相关。
随着培养时间的延长，当这些肺类器官持续培养超过60至70天时，一些较大的圆形结构出现了破裂现象。这些结构的破裂伴随着粘液样物质的释放。
2. 肺类器官标记表达
在第70天，对人外周血单核细胞（PBMC）来源以及人肺成纤维细胞（HFF）衍生的诱导多能干细胞（iPS细胞）所形成的成熟肺类器官进行了标志物的表达分析。
II型肺泡上皮细胞，这类细胞负责产生表面活性物质，以维持肺泡的稳定性，通过表达表面活性物质相关蛋白SFTPC和SFTPB得到了确认。同时，气道杯状细胞，其特征是分泌粘液以保护气道，通过表达Muc5AC标志物得到了验证。
此外，肺内胚层细胞，这是肺部发育过程中的关键细胞类型，通过表达EPCAM（上皮细胞粘附分子）、Sox9（一种转录因子，对肺部发育至关重要）和NKX2.1（一种与肺和甲状腺发育相关的同源框基因）等标志物得到了识别。
纤毛细胞，这类细胞具有运动纤毛，有助于清除气道中的异物和病原体，通过表达Acetyl-α-Tubulin（乙酰化α-微管蛋白，纤毛的主要结构成分）得到了确认。
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