Circular RNA hsa-circ-0002483 promotes growth and invasion of lung adenocarcinoma by sponging miR-125a-3p
环状RNA hsa-circ-0002483通过海绵化miR-125a-3p促进肺腺癌的生长和侵袭
期刊：cancer cell internationaltion 影响因子：5.772 发表日期：2021年 研究背景与意义 肺癌是最恶性的肿瘤之一，其发病率和死亡率正在迅速增加，威胁着公众健康和人类生命。随着治疗方法的发展，肺腺癌（LUAC）作为非小细胞肺癌（NSCLC）的一个亚类已经得到很好的治疗，但晚期病例仍然预后不良，远端转移。累积数据显示，非编码RNA的异常表达与LUAC的预后和进展有关。因此，鉴定与癌症相关的非编码RNA可能为LUAC的早期检测提供潜在的生物标志物。 环状RNA（circRNA）作为非编码RNA的一个亚类，其特征在于共价闭环结构和RNA稳定性。越来越多的数据表明，circRNA表达异常，与LUAC的预后和进展相关。同时，circRNA通过与RNA结合蛋白或海绵化miRNA相互作用，在LUAC中充当致癌或抑制因子。到目前为止，LUAD中circ-0002483的功能仍未记录在案。 MicroRNA（miRNA）作为非编码RNA的另一种亚型，可以通过转录后水平靶向mRNA，并作为LUAC早期诊断和预后的良好生物标志物。一些研究表明，在非小细胞肺癌（NSCLC）中下调的miR-125a-3p和miR-125a-5p对肺癌细胞的迁移和侵袭具有相反的影响，而miR-125a-3p的下调与NSCLC患者的肿瘤发生和预后不良有关。此外，miR-125a-3p通过调节小鼠双分钟2同源物/p53信号传导来抑制肺癌的生长和侵袭，并通过靶向转移相关基因1来抑制NSCLC增殖和迁移。miR-125a-3p也被lncRNA MALAT1在肝细胞癌中海绵化，在脑胶质瘤中被circ-MAPK4海绵化，在系统性红斑狼疮中被circ-0012919海绵化，在主动脉平滑肌细胞中被circLMF1海绵化。 竞争性内源RNA(ceRNA)假说认为,内源性RNA分子具有miRNA作用位点,可以竞争性的与miRNA结合,从而间接调控miRNA靶基因的表达,这种竞争性结合miRNA的作用又被叫做miRNA海绵作用(microRNA sponges) 研究方法 1、临床样本组织微阵列、生信分析鉴定LUAC和正常组织之间差异表达的circRNA。 2、采用荧光原位杂交分析LUAC患者circ_0002483表达与临床病理特征及预后的关系。 3、通过CCK-8、集落形成和Transwell测定等功能实验以及皮下肿瘤模型，确定了circ_0002483在LUAC细胞中的作用。 4、通过RNA免疫沉淀、荧光素酶基因报告和qRT-PCR检测验证了circ_0002483与miR-125a-3p之间的特异性结合。 5、通过蛋白质印迹分析评估circ_0002483对miR-125a-3p介导的C-C基序趋化因子配体4（CCL4）-CCR5轴的影响。 研究主要内容 (A) LUAC和正常组织样品之间差异表达的circRNA的分层聚类。 （B） FISH分析了80个配对LUAC组织样本中circ-0002483的表达水平。 （C） FISH分析LUAC中I期+II期和III期+IV期 circ-0002483表达水平。 （D） Kaplan-Meier分析LUAC患者circ-0002483表达与总生存期的相关性。 结论： circ-0002483的上调与LUAC患者的生存率低有关。 图A：用circ_0002483过表达载体或si-circ_0002483转染A549和PC9细胞后circ_0002483表达水平的qRT-PCR分析。 图B：CCK-8分析A549和PC9细胞中用circ_0002483过表达载体或si-circ_0002483转染后的细胞增殖活力。 图C，D：在A549和PC9细胞中用circ_0002483过表达载体或si-circ_0002483转染后细胞菌落形成分析。 图E，F：分析A549和PC9细胞中circ_0002483过表达载体或si-circ_0002483转染后的细胞侵袭能力。 结论： Circ_0002483促进了A549和PC9细胞体外的增殖、集落形成和入侵 图A：circ_0002483和多个miRNA之间的结合位点。 图B ：TCGA分析成对和不成对的LUAC组织样品中5个miRNA的表达水平。MIR-125a-3p表达水平和细胞位置的。 图C-E：FISH分析，以及LUAC组织样品中circ_0002483与miR-125a-3p表达相关性的Pearson相关性分析（n = 80）。 结论：Circ_0002483与LUAC组织样本中的miR-125a-3p表达呈负相关。 图A：miR-125a-3p与WT或Mut circ_0002483 3′UTR结合位点的示意图。 图B：与miR-125a-3p模拟物或抑制剂以及WT或Mut。circ_0002483 A549和PC9细胞中3'UTR报告载体共同处理后WT或Mut circ_0002483 3′UTR的荧光素酶活性的估计。 图C：用miR-125a-3p模拟物或抑制剂转染后A549和PC9细胞中miR-125a-3p表达水平的qRT-PCR分析。 图D: 用circ_0002483过表达载体或si-circ_0002483转染后A549和PC9细胞中miR-125a-3p表达水平的qRT-PCR分析。 图E、F：RIP分析了从A549和PC9细胞中Ago2蛋白中提取的circ_0002483和miR-125a-3p的富集水平。 图G：CCK-8 分析 A549 和 PC9 细胞中circ_0002483过表达载体和 miR-378a-3p 模拟物；si-circ_0002483 和 miR-125a-3p 抑制剂共转染后的细胞增殖活力。 结论：Circ_0002483在LUAC细胞中充当miR-125a-3p的海绵。 图A：miR-125a-3p与WT或Mut CCL4 3′UTR结合位点的示意图。 图B：与miR-125a-3p模拟物和WT或Mut CCL4 3'UTR报告载体在A549和PC9细胞中共同处理后WT或Mut CCL4 3'UTR的荧光素酶活性的估计。 图C、D ：TCGA分析LUAC组织样品中CCL4和CCR5的表达水平（n = 515）。 图E ：Pearson在LUAC组织样品中miR-125a-3p与CCL4和CCR5表达的相关性分析。 图F、G：qRT-PCR和蛋白质印迹分析与A549细胞中circ_0002483过表达载体和miR-125a-3p模拟物共转染后CCL4和CCR5的表达水平。 结论：miR-125a-3p反转circ_0002483引起的CCL4-CCR5轴上调。 图A：皮下异种移植肿瘤的代表性照片和si-circ_0002483 或si-NC转染A549细胞治疗后肿瘤生长曲线的评估。 图B、C ：si-circ_0002483组和si-NC组之间肿瘤体积和重量的比较。 图D ：si-circ_0002483组和si-NC组之间Ki-67表达水平的HE和IHC分析 结论：敲低circ_0002483抑制了LUAC肿瘤的生长。 研究结果及结论 发现circ_0002483在LUAC组织样本中上调，并且与LUAC患者的肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段和生存率低有关。敲低circ_0002483抑制了A549和PC9细胞在体外的增殖，集落形成和侵袭，而circ_0002483的过表达则具有相反的效果。 此外，circ_0002483海绵化miR-125a-3p并对其表达进行负面调节。CCL4被确定为miR-125a-3p的直接目标。抢救实验表明，miR-125a-3p模拟物通过靶向A549和PC9细胞中的CCL4-CCR5轴，逆转了circ_0002483的肿瘤促进作用。 此外，体内实验进一步证实，敲低circ_0002483抑制肿瘤生长。 结论：研究结果表明，circ_0002483可以作为miR-125a-3p的海绵来上调CCL4-CCR5轴，有助于LUAC的肿瘤发生，并代表LUAC的潜在治疗靶点。 文献中使用的实验技术 关于晶莱
晶莱生物（Geneline Bioscience）是一家专注于生物医药研发与基础医学研究服务的高新技术企业。可开展生物医药临床前非GLP的CRO服务，基础医学研究技术服务，医学成果转化服务，类器官、细胞、动物模型等产品研发业务。目前已在北京、上海、长沙开设公司并建立多个综合实验室，共建设有3000余平实验平台（含SPF动物实验平台、生化病理检测实验平台、细胞/类器官实验平台），组建了数十名来自全球知名高校的硕博研究生研发团队。可开展小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠，兔，犬、猪、猴、相关的动物实验，可构建200余种动物疾病模型，为生物医药公司、高校、医药搭建了多管线研发服务平台。
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