MarvelD3 Is Upregulated in Ulcerative Colitis and Has Attenuating Effects during Colitis Indirectly Stabilizing the Intestinal Barrier

MarvelD3在溃疡性结肠炎中上调，在结肠炎期间具有减弱作用，间接稳定肠道屏障

期刊名：cells；

影响因子：6.9

1、炎症性肠病 (IBD) 包括溃疡性结肠炎 (UC) 和克罗恩病 (CD)，是一组慢性特发性复发和缓解的胃肠道自身免疫性疾病，其发病率在几十年内不断增加。尽管 IBD 几乎可以发生在任何年龄，但大多数患者在 30 岁到 40 岁之间得到诊断。由于缺乏治愈方法，IBD 的治疗旨在获得和维持缓解，并预防并发症。

2、在炎症性肠病（IBD）中，肠道屏障受损的主要特征是紧密连接蛋白表达的改变。紧密连接相关的 MARVEL 蛋白 MARVELD3 (MD3) 在 IBD 中的功能作用尚不清楚。

3、IBD 的形成一般是多种因素导致的，如环境、感染、免疫害以及遗传因素。表现涉及肠道屏障的失调以及粘膜免疫反应的增强。对肠上皮屏障来说，特别重要的是紧密连接(TJ)。TJ是由位于上皮细胞之间的多蛋白复合物构建的，位于最顶端，形成细胞-细胞连接，收紧细胞旁间隙并调节跨上皮通道和屏障特性。有两 种类型的TJ，即形成的双细胞TJ4、在一些实验性的AKI模型中，n3-PUFA的使用与肾功能的改善相关。

4、TJ的跨膜蛋白可以分为四个家族：a、claudin 家族，包括哺乳动物中的 27 个成员；b、连接粘附分子；c、angulin 家族，包括 angulin-1、-2 和 -3 三个成员；d、TJ 相关 MARVEL蛋白 (TAMP)，包括 occludin 、三纤维素和MARVELD3；

5、对于MARVELD3(MD3)，我们还不知道IBD的潜在变化和功能。它被描述为存在于两个剪接变体MD3v1和MD3v2中的TJ蛋白，它们在屏障形成方面的功能尚不明确，似乎在TJ稳定、细胞行为和生存以及发育中更相关。 

研究意义：由于这些因素也可能是可能在IBD受损上皮中发挥作用的因素，所以作者研究过对MD3在IBD中的潜在变化和调节过程。

（1）临床样本：

8例CD患者（乙状结肠检测有炎症）、8例UC患者和8例接受结肠镜检查的无肠道疾病患者（健康对照）。进行乳糜泻内镜评分(SES-CD)；是一种用于乳糜泻患者内镜表现分期的评分系统。该评分考虑了粘膜溃疡的数量和大小，受影响的程度和溃疡表面的程度，以及是否存在狭窄的肠腔。同时进行了Mayo内窥镜亚评分，这个评分用于获取结肠镜检查期间的疾 病表现，用于UC患者。在这里，2到5分表示为轻度，高于6分表示中度至重度疾病活动。

（2）细胞实验：

a、人结肠细胞系 HT-29/B6 ；细胞因子处理细胞；进行基础检测。

b、细胞验证实验：细胞+抑制剂+细胞因子；进行基础检测。

（3）动物实验：

① 构建MD3过表达小鼠：针对该区域的载体构建包含了一个egfp标记版本的小鼠MD3的编码序列，并允许在 crea-重组酶的控制下诱导表达。此外，我们还引入了一个cag启动子，以允许不同的表达强度；将该载体构建物注射到Villin-Cre小鼠[27]的受精卵中。来自这些细胞的小鼠与表达 Villin-Cre重组酶的小鼠杂交，以产生肠上皮细胞过表达GFP标记的MD3的小鼠。这些小鼠与 C57Bl/6NCrl进行10代繁育，并对Cre进行基因分型和GFP作为外源MD3的标记，用于确认引入基因的表达。

② 结肠炎造模：实验中使用的动物为来自杂合子育种的雄性小鼠（12周龄），并以基因典型的野生型同窝小鼠作为对照。小鼠在标准化条件下饲养。右旋糖酐硫酸钠(DSS)用于诱导结肠炎。饮用水中3%的DSS的量被自由给予超过5天。对照组小鼠接受相同的水，没有DSS。

1、临床样本评分：

2到5分表示为轻度，高于6分表示中度至重度疾病活动。

2、 MD3在IBD患者肠上皮中的表达

对 IBD 患者和健康对照的膜蛋白组分的分析显示，MD3 v1 在 UC 中上调（对照：100.0 ± 10.4%，UC：259.9 ± 51.3%），但仅显示 CD 增加的趋势（CD：120.6 ± 1.7 %，p = 0.069)，而 MD3v2 不受影响（对照：100.0 1.1%，CD：97.2 11.1%，UC：84.3 8.0%；图2一种）。

此外，与对照相比，CD 或 UC 患者中 MD3 的定位没有改变，如免疫荧光染色所示（图B).

3、 参与MD3上调的信号通路

为了分析UC中MD3增加的原因因素，作者检测了IBD中几种相关的细胞因子，特别是UC对 MD3表达的影响。

为此，作者使用了人结肠上皮细胞系HT-29/B6。用表2中列出的细胞因子处理 细胞48小时(或用TNF处理24小时)。关于 IL-4，UC 的变化存在争议，因为有下调的报道;因此，重点放在了 IL-13 上。

测试表明，IL-4和IL-13是最有希望参与UC中MD3 上调的候选基因(图A)。

STAT6 抑制剂 SAHA 和 STAT3 抑制剂抑制剂 VI 和 AG490 能够抑制 IL-13 对 MD3 表达的影响，表明这两种 STAT 参与。

 Tanshinone IIa 部分降低了 IL-13 的作用，表明转录 AP-1 可能参与 MD3 表达，但不是主要参与者。MAPK/Erk 通路 (U0126)、JNK (JNKV 和 SP600125) 和 JAK3 的抑制仍导致 MD3 表达增加。这些结果指向 STAT3/6 调节的信号传导，该信号已被描述为通过 IL-13 与 IL-13Rα1 的结合而启动。

3.MD3 在 DSS 诱导的结肠炎中的作用

为了分析 MD3 在结肠炎中的作用，产生了在 Villin-Cre 启动子控制下肠道过表达 MD3 (MD3-OE) 的小鼠。小鼠与wt小鼠无明显表型差异，发育正常。

在雄性 12 周龄小鼠中通过饮用水应用 DSS 诱发结肠炎。

与 DSS 野生型 (wt) 小鼠相比，DSS MD3-OE 小鼠的结肠炎严重程度较低（DAI 较低）（图A），这是基于血便和水样便的发生率较低，但不是体重减轻。

结肠长度（图B) 与各自的对照相比，wt DSS 和 MD3-OE DSS 均降低，而 wt 和 MD3-OE 小鼠的结肠长度或宽度之间没有显着差异。

此外，结肠的组织学外观在任何情况下都没有显着差异（图C）。

在 wt 和 MD3-OE 中，DSS 处理导致隐窝结构扭曲、表层上皮衬里缺失和免疫细胞浸润。然而，在 MD3-OE 动物中，这些变化的程度似乎不太明显，这与它们的粪便外观一致（图C）。

与wt小鼠相比，这些MD3-oe小鼠中MD3的表达大约增加了一倍(图5A)。肠内其他TJ蛋白的 表达没有变化。只有occludin的表达增加，由于巨大的变化，这并不显著(图B，C)。

在wt和MD3-OE中，一些TJ蛋白的表达水平受到DSS的影响(图B，C); 对于claudin-1，与 对照条件下的低表达量相比，测量到的增加变化很大，使得这些变化不显著。Claudin-4也有增加的趋势(也有ns)，但不如Claudin-1明显。

在DSS的影响下，claudin-15和三细胞蛋白明显下调, 在DSS下，wt小鼠的MD3表达上调，与对照条件下MD3-oe小鼠的水平相当(图B，C)。在这些小鼠中，DSS下MD3没有进一步增加。

利用单向阻抗谱对结肠组织进行电生理屏障检查(图A)，结果显示，在稳态条件下，WE和 MD3-OE的屏障性能没有差异。

在wt和MD3-OE小鼠 和dssin诱导的结肠炎小鼠中，HRP的通透性不受影响(图C)。 

此外，我们还分析了不同大小的细胞旁通量标记物。荧光素是一种332Da的小通量细胞旁 标记物，在dss诱导的结肠炎中，仅在wt小鼠中倾向于增加，而这种趋势在MD3-OE小鼠中不可见 。然而，两者之间并没有明显的差异(图D)。

对于大分子4kDaFITC-右旋糖酐(FD4图E)，细胞 旁通透性增加.在 DSS 诱导的结肠炎期间，wt 小鼠和 MD3-OE 小鼠彼此之间没有差异。

 10 kDa FITC-葡聚糖也观察到了类似的增加（FD10 图F）。有趣的是，未处理的 MD3-OE 小鼠对 FD10 的渗透性已经明显高于 wt 小鼠。然而，与结肠炎小鼠的增加相比，这仍然处于较低的范围内。