FTO suppresses glycolysis and growth of papillary thyroid cancer via decreasing stability of APOE mRNA in an N6- methyladenosine-dependent manner

FTO通过以N6-甲基腺苷依赖的方式降低APOE mRNA的稳定性来抑制糖酵解和甲状腺乳头状癌的生长

期刊名：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

2022年影响因子/JCR分区：12.658/Q1                       

1、甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，其全球发 病率在过去几十年呈显著趋势。2020年全球癌症统计数据显示，甲状腺癌发病率为恶性 肿瘤中第9大主要癌症病例。约 95%的甲状腺癌病理类型是由分化型甲状腺癌(DTC)组成 的，其中DTC最常见的病理亚型是甲状腺乳头状癌 (PTC)。大多数PTC病例在经过标准手术、TSH抑制和 放射性碘治疗后预后良好。

2、N6-甲基腺苷（m6A)修饰是哺乳动物mRNA中最常见的化学修饰，它通过调节多种细胞过程发挥重要作用。最近的研究报告称，m6A 修饰在调节各种癌症的发生和进展中起着重要作用，然而，在甲状腺乳头状癌(PTC)中，m6A修饰和m6A去甲基化酶FTO对糖代谢的调节失调尚未完全阐明。

3、局限性：大多数PTC病例在经过标准手术、TSH抑制和放射性碘治疗后预后良好。然而，约30%的患者出现复发和远处转移，从而显著降低了生存率。此外，PTC 的发生和进展受到基因突变、环境暴露、表观遗传改变等因素的影响。然而，PTC发生发展的特殊分子机 制尚未完全阐明。因此，需要探索PTC发生发展的分子机制，并确定PTC新的诊断和治疗靶点。

4、重新编程能量代谢是癌症的一个标志。研究已经探索了能量代谢的重编程，并报道了靶向糖酵解是一种很有前途的治疗策略。然而 ，糖酵解在PTC中的具体作用和机制尚未阐明。

5、此外，癌细胞的有氧糖酵解伴随着脂质代谢的失调，脂质代谢的一些关键因素可能在细胞的糖酵解中发挥作用。载脂蛋白E(APOE)是血浆脂蛋白的主要成分，负责胆固醇的运输和代谢。虽然APOE在胆固醇 稳态中的作用及其在动脉粥样硬化和老年痴呆疾病 中的调节机制众所周知，但APOE在癌症中的作用和机制尚不清楚。APOE在胃癌中的表达显著上调，并与较短的生存期相关。此外，APOE的上调与肌肉侵袭呈正相关，因此是预测侵袭程度的潜在生物标志物。然而 ，APOE在PTC中的表达谱和功能尚不清楚。

本研究探讨了 m6A 修饰在 PTC 中的作用。随后探讨了去甲基化酶 FTO 的抗癌基因作用及其与 PTC 临床病理特征的关系。机理研究表明，FTO 调节 PTC 的糖酵解和生长，这依赖于 APOE 的 m6A 修饰。进一步分析表明，FTO 通过调节 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路发挥其活性。目前的研究结果为 m6A 修饰在调节糖酵解和 PTC 生长中的潜在机制提供了新的见解。

1、PTC中m6A修饰异常，FTO表达下调

FTO在PTC中基因及蛋白表达水平均显著下调，并可能通过m6A修饰调控PTC的进展。TCGA数据集(图1.A)和GEO数据集(图1.B)分析显示，与正常组织相比，PTC组织中去甲基化酶FTO的基因表达显著下调。作者进而通过qRT-PCR检测了30对(图1.C)和100对(图1.E)PTC组织样本，结果同样显示，在PTC组织中FTO基因表达下调。且与去甲基化酶表达下调一致，PTC组织中m6A的总体水平高于配对非癌组织(图1.D)。免疫组化法(图1.F)和免疫印迹分析(图1.G)结果显示，PTC组织中FTO蛋白表达下调。

这些结果表明，FTO在PTC中基因及蛋白表达水平均显著下调，并可能通过m6A修饰调控PTC的进展。

2、FTO在体内、体外抑制PTC肿瘤生长

作者检测了FTO在正常人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1和4种PTC细胞系(K1、BCPAP、IHH4和TPC1)中的相对表达，结果显示IHH4和BCPAP中FTO的表达量略低于Nthy-ori3-1细胞系(图2.A)。

因此，与PTC组织中FTO的表达趋势一致的KI和TPC1细胞系被运用于后续研究。作者首先通过qRT-PCR和WB验证了FTO敲低和FTO过表达的有效性(图2.B-C)。

进一步的研究结果显示，FTO的敲低或过表达分别增加或降低了PTC细胞的整体m6A修饰水平(图2.D)。而CCK-8检测和集落形成检测结果显示，FTO敲低显著促进了PTC细胞的增殖(图2.E-F)。

此外，研究表明，过表达FTO抑制了PTC细胞的增殖，而过表达FTO-mut (去甲基化结构域缺失)无细胞增殖(图2.G-H)，暗示FTO诱导的PTC增殖依赖于其去甲基化酶的功能。进一步体内实验结果显示，在异种移植小鼠模型中，敲低或过表达FTO显著增加或降低了肿瘤的生长和肿瘤重量(图2.I-N)。

然而，在过表达FTO-mut后，在体内未观察到FTO对肿瘤生长的影响(图2.L-N)，表明FTO通过其去甲基化结构域抑制PTC肿瘤生长。

3、 FTO通过调节糖酵解来抑制PTC的生长

FTO可以通过控制能量消耗来维持能量稳态。为了确定FTO对PTC糖酵解代谢的调控作用，作者通过ECAR代谢分析，发现FTO敲低显著增加了K1和TPC1细胞中ECAR水平(图3.A)，表明其可抑制PTC中的糖酵解。

糖酵解产生大量的乳酸，并且糖酵解中间体可能被转移到各种生物合成途径中。体外实验分析显示，在FTO敲低后，PTC细胞的葡萄糖摄取和乳酸产量显著增加(图3.B-C)，而过表达FTO显著降低了PTC细胞中的ECAR水平、葡萄糖摄取和乳酸生成(图3.I-K)。作者进一步测定了FTO敲低后糖酵解中关键酶的表达水平，来分析糖酵解的调控机制。

QRT-PCR(图3.D)和免疫印迹法(图3.E)结果显示，在FTO敲低后，K1细胞中，GLUT1、HK-II和LDHA 基因和蛋白表达水平显著上调，而过表达FTO后，GLUT1、HK-II和LDHA蛋白的表达显著下调(图3.L)。而用糖酵解抑制剂2-DG处理PTC细胞后，FTO敲低引起的细胞增殖和集落形成被抑制(图3.F-G)。

体内实验结果也显示，敲低或过表达FTO基因后，异种移植小鼠肿瘤模型中的葡萄糖摄取显著增加或降低(图3.H/M)。然而，过表达FTO-mut后，在体内和体外均未观察到对糖酵解的影响(图3.I-M)，表明FTO依赖其去甲基化结构域调节糖酵解。

综上所述，这些研究表明FTO通过调节糖酵解来抑制PTC的进展。

4.RNA-seq和MeRIP-seq确定APOE为FTO的靶基因

为了探索FTO在PTC中的下游潜在靶点，作者采用K1细胞进行RNA-seq检测了si-NC组和si-FTO组的表达差异基因(DEGs)。结果显示，FTO基因敲低后，有490个基因表达显著下调，而有675个基因表达显著上调(图4.A)。

为了验证基因表达的变化是否与FTO介导的m6A修饰有关，作者采用m6A MeRIP-seq筛选在K1细胞中FTO敲低后显著升高的m6A峰。m6A MeRIP-seq组在si-NC组有2553个独特的m6A峰，在si-FTO组有1989个独特的m6A峰，两组有8496个共有的m6A峰(图4.B)。

分析显示，在si-NC和si-FTO组中，m6A峰在终止密码子附近高度富集(图4.C)。对K1细胞中m6A甲基化组的分析显示，最常见的m6 A基序“GGACU”在m6A峰中高度富集(图4.D)。

接下来，作者筛选了7个m6A甲基化水平及基因表达水平均上调的基因，进行进一步的功能实验，其中APOE可能是FTO介导的m6 A修饰的关键基因，因为它可以调节PTC的糖酵解代谢(图4.E)。

对m6A MeRIP-seq结果进行IGV可视化，显示APOE mRNA在终止密码子附近有一个在FTO敲除后显著升高的m6A峰(图4.F)。然而，APOE在PTC中的表达和生物学功能有待进一步阐明。

因此，作者选择APOE作为FTO介导的m6A修饰的靶基因进行后续分析。

5.FTO通过IGF2BP2介导的m6A修饰调节APOE mRNA的稳定性

与m6A MeRIP-seq分析结果一致，FTO的敲低或过表达上调或下调了APOE的基因及蛋白表达水平(图5.G-J)，且过表达FTO-mut后，APOE的表达没有发生变化(图5.H-J)。

为了探索FTO对APOE的m6A修饰，作者使用了一种甲基化抑制剂DAA处理，结果显示DAA显著降低了FTO敲低所上调的APOE的表达(图5.K)。

接下来，作者采用MeRIP-qPCR方法验证来m6A MeRIP-seq数据，结果显示，在FTO敲低后，APOE mRNA的m6A水平显著升高(图5.I-M)。随后，作者构建了包含野生型或突变型APOE的荧光素酶报告基因，以探索m6A修饰对APOE表达的影响。结果显示，敲低或过表达FTO显著增加或降低了野生型APOE的荧光素酶活性，而对突变型APOE的荧光素酶活性没有明显的影响(图5.N-O)。

这些结果表明，FTO在APOE的m6A修饰中起着一定的作用。

此外，APOE的表达随着m6A修饰水平的增加而显著增加，提示其m6A修饰可能增加了APOE mRNA的稳定性。与预期结果一致，RNA稳定性曲线显示，在K1和TPC1细胞中，FTO敲低后，APOE mRNA的半衰期显著延长(图5.P)。

因此，FTO诱导的APOE表达上调可归因于m6A修饰导致的APOE mRNA稳定性的增加。作为m6A readers，IGF2BP1-3可调节mRNA的稳定性，进一步分析显示，敲低IGF2BP2，而不是IGF2BP1/3，显著下调了K1和TPC1细胞中的APOE mRNA(图5.Q)。此外，在K1和TPC1细胞中，IGF2BP2基因敲低后，APOE mRNA的半衰期显著降低(图5.R)。

针对IGF2BP2的RIP-qPCR结果表明，IGF2BP2直接与APOE的m6A位点结合(图5.S)，而FTO的下调显著增加了IGF2BP2与APOE mRNA的结合能力(图5.T)。

综上所述，这些结果表明，FTO通过IGF2BP2介导的m6A修饰来抑制APOE mRNA的稳定性和表达。

6、APOE通过调节糖酵解来调节PTC的增殖

虽然FTO通过调节糖酵解在PTC生长中发挥重要作用，但尚不清楚该作用是否归因于其下游靶基因APOE。作者通过qRT-PCR检测发现PTC组织中APOE的mRNA表达相对于成对非癌组织显著上调(图6.A)，且与FTO的表达水平呈显著负相关(图6.B)。

与此结果一致，FTO和APOE在TCGA数据库中的表达也呈明显的负相关(R=-0.259，p=2.96e-09)(图6.C)。此外，PTC组织中APOE蛋白的表达明显高于邻近非癌组织(图6.D)。

为了探究APOE在PTC中的作用，作者发现敲低APOE显著降低了si-FTO诱导的高细胞增殖水平(图6.E-F)，高ECAR水平(图6.G)以及葡萄糖摄取和乳酸生成的增加(图6.H-I)，这表明APOE可以逆转FTO引起的糖酵解速率的增加。

对关键糖酵解蛋白表达分析显示，APOE敲低后，只有GLUT1蛋白的表达显著下调，而HK-II和LDHA的表达水平未被影响(图6.J)，表明FTO和APOE主要通过调节葡萄糖转运来影响糖酵解。与FTO相似，2-DG抑制了过表达APOE引起的增殖增加(图6.K)，表明APOE通过糖酵解影响细胞增殖。

体内分析显示，在由sh-FTO引起的异种移植小鼠模型中，sh-APOE显著降低了肿瘤生长(图6.L-M)，肿瘤重量(图6.N)以及葡萄糖摄取(图6.O)。

这些结果表明，APOE可以通过糖酵解促进肿瘤生长，并在PTC中受到FTO介导的m6A修饰的调控。

7、FTO和APOE可能通过IL6/JAK2/STAT3信号通路调控PTC的糖酵解

为了探索FTO/APOE轴下游的相关信号通路，作者采用基因集合富集分析(GSEA)来鉴定PTC中FTO和APOE的富集特征，发现，FTO/APOE下游的共同信号通路只有IL-6/JAK/STAT3信号通路。基于RNA-seq数据的GSEA结果显示，与si-NC组相比，si-FTO组中IL-6/JAK/STAT3信号通路高度富集(图7.A)。

此外，基于TCGA数据库的GSEA结果显示，APOE高表达组与低表达组相比，IIL-6/JAK/STAT3信号通路高度富集(图7.B)。

这些GSEA研究结果表明，FTO和APOE可能通过调节IL6/JAK/STAT3信号通路来影响PTC的糖酵解。

随后，作者通过WB实验发现FTO敲低后，该通路中磷酸化的JAK2(pJAK2)和STAT3(pSTAT3)的蛋白表达水平显著升高，而过表达FTO则相反(图7.C-D)。

此外，在APOE敲低后，这两种磷酸化蛋白的蛋白表达水平显著降低，而过表达APOE的作用则相反(图7.E-F)，且APOE敲低显著消除了si-FTO引起的pJAK2、pSTAT3和GLUT1蛋白表达水平的升高(图7.G)。

综上所述，APOE在PTC中，通过FTO修饰m6A后调节IL6/JAK2/STAT3信号通路，对糖酵解发挥作用。

本文通过一系列体内外功能实验发现去甲基化酶FTO抑制了PTC的糖酵解和生长，并通过RNA-seq、m6A MeRIP-seq联合分析鉴定得到了FTO下游靶基因APOE。

作者通过对APOE的进一步机制及功能研究，发现FTO通过IGF2BP2介导的m6A修饰抑制APOE的表达，且可能通过调节IL-6/JAK2/STAT3信号通路来抑制PTC的糖酵解代谢，从而抑制肿瘤生长。

该文章为从甲基化修饰酶出发的m6A机制研究提供了一个极佳的参考范本。文中机制研究涉及到的整体甲基化水平检测，RNA修饰相关酶筛选，RNA-seq&m6A MeRIP-seq，以及后续MeRIP-qPCR验证，RIP-qPCR机制互作研究等。

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