1. 实验条件和人员培训

建立FISH技术平台，除需要一间可以进行荧光实验操作和显微观察暗室外，还需要原位杂交仪、荧光显微镜、显微镜滤光片、水浴箱、漩涡混合器、普通离心机、移液器、FISH探针试剂盒、无水乙醇、二甲苯、去离子水、橡胶水泥、透明指甲油等设备和试剂。

由于FISH检测具有敏感性和客观性，任何一个步骤的微小失误均有可能对结果的判读产生偏差，因此就对操作的技术人员在熟练和规范程度做出更高的要求。

建议每一个开展分子病理检测的病理科设置专门的分子病理室并由专人操作，并且要求专门的技术人员有相关的分子生物学理论知识，并经过专门培训，有一定的实验室工作经验。

2. 固定液的选择及固定时间

①石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定12～48h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。

②组织标本离体后应尽快固定，较大标本切开固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。（尤其环境温度较高时更应及时固定）

③固定液体积应不少于标本体积的10倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。

④为了保证信号的准确性，蜡块最好在2年内进行检测，已经切好的切片在6周内检测最佳。

3. 组织切片和载玻片的选择

组织切片4～5μm厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，切片过厚将导致杂交不充分，最终信号点发生重叠，影响计数。而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。

载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

4. 切片的预处理

切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。

①当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。

②酶消化是FISH实验的关键步骤之一，如果对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染DAPI在荧光显微镜下观察，在DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。

③对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。

5. 变性和杂交

变性和杂交是本实验最关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，变性和退火温度对荧光信号影响较大，变性和退火温度过低会导致杂交效率变低，使荧光信号变弱，变性和退火温度过高易出现高背景。

为保证变性期间温度的稳定，建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。

为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

6. 杂交后洗涤温度、时间和封片保存

应保证正确配置杂交洗涤液，洗涤液温度偏高或时间过长，可导致信号减弱，洗涤液温度偏低或者时间过短，会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。

在复染完DAPI以后，加盖盖玻片，用指甲油固定住盖玻片四角，这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于荧光信号容易淬灭，所以在染色后应立即观察，如果当时不能观察，可将切片放入切片盒中，保存于－20℃冰箱里2周以内。

7. 设置对照

每次实验需设置标准对照:实验室在每一轮检测中均应使用标准化对照材料(阳性、阴性和可疑)。如果对照材料没有显示预期的结果，则不能对结果做出判定。

8. FISH技术有哪些主要优势？

① 安全、快速、灵敏度高；

② 探针能较长时间保存；

③ 多色标记，简单直观；

④ 可用于中期染色体及间期细胞的分析；

⑤ 可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。