Long noncoding RNA NEAT1 promotes ferroptosis by modulating the miR-362-3p/MIOX axis as a ceRNA
长链非编码RNA NEAT1作为ceRNA通过调节miR-362-3p/MIOX轴促进铁死亡
期刊：Cell Death & Differentiation
发表时间：2022-03-25
影响因子：12.067
研究背景
肝癌（HCC）的发病率和死亡率位居中国癌症排行榜前五，2016年的死亡率位居第二，仅次于肺癌。（疾病背景）
长非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200nt的RNA，LncRNA可以像海绵一样，作为竞争性内源RNA (ceRNA)吸附miRNA，以减少miRNA对其靶mRNA的调节（作用机制）。LncRNA NEAT1 有2个转录本NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2 (23 kb)，在多种人类肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞增殖、迁移、周期和凋亡的调控，从而促进肿瘤发展并与肿瘤患者预后不良相关。
铁死亡（Ferroptosis）是一种由铁依赖的脂质过氧化诱导的新型调节性细胞死亡，在肿瘤的发生和耐药中起着重要作用，近年来，越来越多的研究发现LncRNA参与了细胞铁死亡。
肌醇加氧酶（Myo-inositol oxygenase，MIOX）是一种33kDa的非血红素铁蛋白，通过葡萄糖醛酸-木糖途径将肌醇代谢为D-葡萄糖醛酸。MIOX上调促进ROS的产生，减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和谷胱甘肽(GSH)，导致细胞抗氧化能力下降。
技术路线
研究结果及分析
1.1 NEAT1在erastin和RSL3诱导的铁死亡中上调
a. HepG2细胞RNA-seq；
b. 重叠基因列表；
c. UALCAN数据库分析；
d. HepG2细胞中5个lncRNAs的读取计数；
e. NEAT1基因亚型及p53结合位点示意图；
f. 诱导剂促进NEAT1基因mRNA表达。
1.2 erastin和RSL3诱导的NEAT1表达由p53介导
g、h. 干扰p53后，NEAT1的mRNA表达未受到影响；
i. ChIP-qPCR：p53显著富集；
j. 荧光素酶报告基因：诱导剂增加了NEAT1野生型启动子活性。
2. NEAT1促进erastin和RSL3诱导的铁死亡
a. shRNA干扰位置图；
b. Northern Blot检测干扰稳转株中NEAT1两个转录本的表达；
c. CCK-8：敲降NEAT1能抑制erastin和RSL3诱导的铁死亡。
d. 酶标法检测MDA；
e. 流式检测脂质ROS；
f. 酶标法检测Fe2+。
敲降NEAT1显著抑制了MDA、ROS和Fe2+的积累。
MDA（丙二醛）是脂质ROS的终产物，铁死亡的关键：Fe2+和脂质ROS。
3.NEAT1通过调节MIOX的表达来调控铁死亡
a、b. RNA-seq分析：敲降NEAT1后，599个上调、711个下调基因对Erastin无反应；
c. 火山图：反映a和b中NEAT1调节的差异表达基因。6个上调，15个下调；
d. qPCR：诱导剂无法诱导NEAT1敲降的细胞中MIOX的上调；
铁死亡诱导的MIOX表达依赖于NEAT1。
e. CCK-8：MIOX的过表达挽救了由NEAT1干扰抑制的铁死亡；
f-h. MDA、ROS和Fe2+检测。
4. MIOX通过调节Fe2+, GSH和NADPH促进铁死亡
a. CCK-8：MIOX的过表达促进了erastin和RSL3诱导的铁死亡；
b-d. Fe2+, GSH和NADPH检测。
GSH：抗氧化剂，清除胞内脂质H2O2，防止铁死亡；
NADPH：有助于消除脂质ROS，调节细胞对铁死亡的敏感性。
铁死亡诱导剂：
Erastin：半胱氨酸↓，GSH↓，ROS↑
RSL3：结合GPX4活性位点
e. CCK-8：敲降MIOX抑制了erastin和RSL3诱导的铁死亡；
f-h. Fe2+, GSH和NADPH检测；
i. MIOX调节铁死亡的机制示意图。
5.1 MiR-362-3p参与NEAT1对MIOX的调节
a. 预测工具：在NEAT1中寻找潜在的miRNA结合位点；
b. 预测工具：在MIOX中寻找潜在的miRNA结合位点；
c. 预测结果比对：筛选出了唯一重叠的miR-362-3p；
d. 序列比对：NEAT1、MIOX、miR-362-3p；
e. WT和MUT示意图。
5.2 MiR-362-3p与NEAT1和MIOX相互作用
f、g. qPCR：敲降or过表达NEAT1会增加or降低miR-362-3p的表达；
h. 荧光素酶报告基因实验：miR-362-3p的过表达显著抑制野生型NEAT1的转录活性；
i. 荧光素酶报告基因实验：miR-362-3p对MIOX-3’UTR的活性可以通过NEAT1过表达而部分恢复。
j. qPCR+WB：干扰miR-362-3p显著增加了由NEAT1敲降导致的MIOX表达的下调；
k. qPCR+WB：miR-362-3p的过表达显著抑制了由NEAT1诱导的MIOX的表达；
l、m. RIP：Ago2-miR-362-3p复合物降低的MIOX mRNA水平在NEAT1缺失的HepG2中显著富集。
miRNA以Ago2依赖的方式抑制mRNA翻译；
MIOX和miR-362-3p之间的相互作用受NEAT1表达水平的影响。
6. MiR-362-3p通过调节MIOX抑制铁死亡
a. CCK-8：过表达miR-362-3p能降低MIOX所导致的促进细胞死亡作用；
b-d. MDA、ROS、Fe2+检测：过表达MIOX后，得到恢复；
e、f. GSH和NADPH检测：MIOX过表达抑制了由miR-362-3p诱导的GSH和NADPH水平。
g. CCK-8：下调miR-362-3p显著促进了铁死亡，而MIOX的敲降抑制了由miR-362-3p下调导致的铁死亡；
h-j. MDA、ROS、Fe2+检测：下调miR-362-3p显著促进MDA、ROS、Fe2+的积累；
k、l. GSH和NADPH检测。
7. NEAT1过表达促进erastin或RSL3在体内外诱导的铁死亡
a. 克隆形成：慢病毒构建稳转株；NEAT1过表达增加了erastin和RSL3诱导的铁死亡；
b、c. 皮下移植细胞+腹腔注射小鼠erastin或RSL3；
d、e. MDA、GSH检测。
f.免疫组化和原位杂交染色。
4-HNE是一种氧化应激标志物，脂质过氧化的主要产物，ROS激活脂质氧化，从而产生4-HNE。
文献结论
NEAT1是p53的直接靶基因，在erastin或RSL3诱导的肝癌细胞铁死亡期间显著上调。NEAT1可以竞争性结合更多的miR-362-3p，从而减少miR-362-3p介导的MIOX降解，进而增加肝癌细胞对铁死亡的敏感性。
总之，文章结果表明NEAT1是一种重要的lncRNA，在铁死亡中发挥了新的、不可或缺的作用。
临床意义：
NEAT1影响肿瘤对化疗药物的敏感性，对于NEAT1高表达的患者，铁死亡疗法与其他疗法相结合将会取得更好的治疗效果。
文献总结
创新点：
1.首次揭示了lncRNA NEAT1在铁死亡中的作用
erastin或RSL3诱导肝癌细胞中NEAT1高表达，NEAT1通过竞争性地结合miR-362-3p以降低靶基因MIOX的降解，即促进MIOX表达，高表达的MIOX能增加ROS产生并降低细胞内NADPH和GSH水平，从而进一步加剧erastin或RSL3诱导的铁死亡。
2.为临床治疗肝癌提供了新思路
对于NEAT1高表达的患者，铁死亡疗法与其他疗法相结合将会取得更好的治疗效果。
文献使用的实验技术
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