NUCKS1, a LINC00629-upregulated gene, facilitated osteosarcoma progression and metastasis by elevating asparagine synthesis
NUCKS1通过上调天冬氨酸的合成，促进了骨肉瘤的发展与转移
期刊：Cell Death and Disease
发表时间：2023年7月17日
影响因子：9.0
研究背景
骨肉瘤（OS）是最常见的恶性骨肿瘤，主要影响年轻，成长的青少年。然而，在50岁或以上患有佩吉特病的人中，它也有第二个发病率高峰。局限性骨肉瘤因手术和多药化疗肉瘤患者的5年相对生存率为60-70%。然而，在转移发生后，5年生存率下降到20%以下。因此，揭示骨肉瘤转移的机制和识别新的靶点对骨肉瘤的治疗至关重要。
NUCKS1位于人类染色体1q32.1上，属于高迁移率族蛋白，存在于各种脊椎动物细胞类型和组织中。NUCKS1是细胞周期蛋白依赖性激酶、酪蛋白激酶2（CDK2）、DNA损伤反应（DDR）激酶ATM和DNA活化蛋白激酶（DNA-PK）的磷酸化底物。据报道，NUCKS1在许多癌症中发挥着致癌作用，包括宫颈鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌和肝细胞癌。然而，其在骨肉瘤中的作用和调节机制尚不清楚。
天冬氨酸合成酶（ASNS）催化天冬氨酸和谷氨酰胺转化为天冬酰胺和谷氨酸。临床上，ASNS功能障碍与儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）和天冬酰胺合成酶缺乏症（ASD）相关。ASNS和天冬酰胺对许多实体肿瘤也至关重要。例如，ASNS通过调节β-连环蛋白的稳定性来增加并促进细胞转移。强制表达ASNS可降低营养应激下肺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞。下调ASNS基因抑制了乳腺癌和胃癌细胞的细胞增殖。在结直肠癌中，SOX12通过上调ASNS表达来促进细胞增殖和转移。虽然有报道称ASNS对几种肿瘤的进展至关重要，但其在骨肉瘤中的作用和潜在机制仍不清楚。
技术路线
研究结果及分析
1. NUCKS1在体内外均能促进骨肉瘤细胞的生长和转移
A. 通过WB检测结果显示：与对照组相比，shRNA组中NUCKS1的表达量明显降低；
B和C. 通过细胞集落形成实验,与对照组相比，抑制NUCKS1的表达显著减少了菌落的数量；
D和E. 通过Transwell检测，nucks1缺失细胞的迁移程度明显低于对照组细胞；
F.通过WB检测验证过表达NUCKS1。
G-J. 通过细胞集落形成实验和免疫组化结果表明NUCKS1表达的升高促进了细胞的增殖和迁移；
K-M. 通过动物实验结果表明NUCKS1基因敲除的143B细胞显著抑制了肿瘤的形成；
N. 通过免疫组化结果表明NUCKS1基因的下调降低了ki-67阳性细胞的百分比，增加了caspase3阳性细胞的比例；
O和P.通过动物实验和HE染色结果表明敲除NUCKS1的细胞转移病变数量显著减少。
NUCKS1在143B和MNNG / HOS细胞中被敲倒。通过蛋白质印迹法检测NUCKS1的表达水平。
2.NUCKS1是骨肉瘤的关键致癌基因
A. 在TNMplot数据库中，与正常组织相比，骨肉瘤中NUCKS1的表达明显增加；
B和C. 通过免疫组化检测结果表明骨肉瘤组织中NUCKS1的表达量高于正常骨组织；
D和E. 通过免疫组化结果显示，NUCKS1的表达与骨肉瘤的分期呈正相关；
F和G. 通过数据库分析，NUCKS1表达水平高的骨肉瘤患者生存率低于NUCKS1水平较低的患者。
这些数据强烈表明NUCKS1是骨肉瘤的关键癌基因。
3. NUCKS1可以结合ASNS的启动子，上调骨肉瘤细胞中ASNS的表达
A和B. 通过RNA-seq鉴定了NUCKS1的下游基因，共获得328个下调基因和160个上调基因；
C. 在这些基因中，发现ASNS在NUCKS1缺失的细胞中被下调；
D和E.结果表明NUCKS1的缺失显著下调了ASNS的mRNA和蛋白水平；
F和G. 过表达NUCKS1促进了ASNS的表达。
H. 在ASNS上游序列和不同截断插入基于PG13的荧光素酶报告质粒（命名 P1 P2 P3 P4）；
I. 通过测定结果显示过表达NUCKS1提高了P1和P2的荧光素酶活性，表明该区域是NUCKS1上调ASNS表达的必要区域；
J.克隆该区域（-750~-500bp），并插入荧光素酶报告质粒中，再转染到过表达和正常表达NUCKS1的MNNG/HOS细胞中，结果表明过表达NUCKS1提高了P5的荧光素酶活性；
K. NUCKS1的缺失降低了P5的荧光素酶活性；
L和M.通过染色质免疫共沉淀（ChIP）检测显示，含有p5的染色质片段在抗NUCKS1免疫共沉淀中特别富集，并且在NUCKS1缺失的MNNG/HOS细胞中，NUCKS1与ASNS启动子的结合能力降低。
综上所述，这些发现表明NUCKS1可以结合ASNS的启动子并上调骨肉瘤细胞中的ASNS表达。
4. NUCKS1可以提高天冬酰胺的合成，并抑制L-ASNase诱导的骨肉瘤细胞死亡
A. ASNS是一种在天冬氨p依赖反应中催化天冬氨酸（Asp）和谷氨酰胺（Gln）合成天冬酰胺（Asn）和谷氨酸（Glu）的关键酶。
B和C. 敲除NUCKS1降低了ASNS的活性
D. 过表达NUCKS1提高了ASNS的活性
E和F. 用EdU染色法检测其增殖能力，表明NUCKS1以一种依赖于天冬酰胺合成的方式促进骨肉瘤细胞的生长。
G和H. 与对照组细胞相比，NUCKS1表达降低减少了天冬酰胺的数量；
I. 高表达NUCKS1提高了天冬酰胺的水平；
J和K. L-天冬酰胺酶可促进ASNS低的肿瘤细胞凋亡，通过PI染色法进行细胞凋亡实验结果表明敲除NUCKS1促进了L-ASNas诱导的细胞死亡。
综上所述，这些发现表明NUCKS1可促进天冬酰胺的合成并抑制l-ASNase诱导的骨肉瘤细胞死亡。
5. NUCKS1 通过提高 ASNS 表达促进骨肉瘤肿瘤发生和转移
A. 与对照组相比，shRNA组ASNS的表达明显降低；
B-E. 通过细胞集落形成实验，结果显示ASNS的下调抑制了骨肉瘤细胞的生长和迁移；
F.在ASNS敲除的骨肉瘤细胞中过表达NUCKS1。
G-J. 通过单克隆实验和Transwell检测发现抑制ASNS减弱了NUCKS1对细胞的影响；
K-M. 通过动物体内实验结果表明抑制ASNS削弱了NUCKS1对肿瘤重量和体积的影响；
N和O.HE染色结果表明抑制ASNS削弱NUCKS1对肺转移的促进作用。
这些结果表明NUCKS1部分依赖于ASNS促进骨肉瘤细胞的生长和转移。
6. 骨肉瘤中ASNS升高与NUCKS1表达呈正相关
A. 通过TNMplot数据库表明骨肉瘤中ASNS表达水平冥想升高；
B和C. 免疫组化结果显示ASNS在骨肉瘤组织中的表达高于正常骨组织；
D.ASNS的表达水平与骨肉瘤的分期呈正相关；
E和F.通过数据库总结ASNS水平相对较高的患者比ASNS水平较低的患者生存率更低；
G和H.与NUCKS1低表达的骨肉瘤组织相比，ASNS在NUCKS1高表达的骨肉瘤组织中表达上调。
这些数据有力地验证了骨肉瘤组织中ASNS的增加，并且ASNS的表达与NUCKS1呈正相关。
7. LINC00629 促进骨肉瘤细胞中 NUCKS1 和 ASNS 的表达
A和B. 通过蛋白组学鉴定了在MNNG/HOS细胞中LINC00629敲除与否的差异表达蛋白，结果表明在敲除LINC00629的细胞中NUCKS1被下调；
C和D. 在敲除LINC00629的骨肉瘤细胞中检测NUCKS1的表达，结果表明与对照组相比敲除LINC00629降低了NUCKS1和ASNS的表达；
E和F.过表达LINC00629促进了NUCKS1和ASNS的表达；
G和H.采用WB和qRTPCR法检测ASNS的表达，结果表明敲除NUCKS1会抑制LINC00629 对 ASNS 的上调作用；
I.通过测量双荧光素酶活性显示抑制 NUCKS1 可逆转 LINC00629 对 ASNS 启动子活性的影响。
这些结果揭示了 LINC1 促进骨肉瘤细胞中 NUCKS<> 和 ASNS 表达。
8. LINC00629 与 miR-4768-3p相互作用 ，促进骨肉瘤细胞中 NUCKS1 的表达
A. 通过数据库检索相关miRNAs合并在维恩图中，鉴定出重叠的miRNAs；
B. 结果表明前三个miRNAs降低LINC00629的荧光素酶活性，表明可能与LINC00629结合；
C.将这三种miRNAs转染骨肉瘤细胞，采用WB检测NUCKS1的表达，miR-4768-sp显著降低了NUCKS1的表达；
D.结果显示抑制miR-4768-3p增加了NUCKS1蛋白水平；
E.将可能含有miR-47683p结合位点的NUCKS1的野生型或突变型3ʹUTR克隆到pSICHECK2载体中；
F.将质粒转染到有或没有过表达miR-4768-3p的细胞中，过表达的细胞荧光素酶活性在野生型降低，当结合位点发生突变，酶活性的下降消失。
G. 结果表明抑制miR-4768-3p提高野生型NUCKS1 3’UTR的荧光素酶活性，而对突变体没有影响；
H. 为了鉴定miR-4768在LINC00629上的阳性结合位点并确认它们的关系，作者将LINC00629和两个截断插入pSICHECK2载体，分别为WT、BS1和BS2；
I.结果显示miR-4768-3p抑制了LINC00629 WT和BS2的荧光素酶活性，而对BS1的活性没有影响；
J.将野生型或突变型的LINC00629 BS2克隆到pSICHECK2载体中
K.miR-4768-3p抑制了LINC00629 BS2 WT的荧光素酶活性，而对BS2 Mut没有影响；
L.抑制miR4768-3p也同样提高了LINC00629 BS2 WT的荧光素酶活性，对BS2 Mut无影响。
数据表明LINC8作为miR-00629-4768p海绵并促进骨肉瘤细胞中的NUCKS3表达。
9. LINC00629 通过与 miR-4768-3p 完全结合，激活 NUCKS1/ASNS 并促进天冬酰胺的合成
A. 将miR4768-3p转染到LINC00629的143B和MNNG/HOS细胞中，WB验证结果显示过表达miR-4768-3p抑制LINC00629诱导的NUCKS1和ASNS的表达；
B. 将含有miR-4768-3p的野生型结合位点（WT）或突变结合位点（Mut）的全长LINC00629插入到pCDH载体中，LINC00629 WT显著提高了NUCKS1和ASNS的表达，但当结合位点发生突变时，表达降低；
C和D.结果显示敲低LINC00629降低了ASNS活性和天冬酰胺（Asn）水平；
E和F.LINC00629 WT的过表达提高了ASNS的活性和Asn水平。
G-N. 通过细胞克隆实验和Transwell检测结果显示LINC00629促进了骨肉瘤细胞的生长和迁移。然而，LINC00629 Mut或miR-4768-3p抑制了促进作用。
这些数据表明LINC00629激活NUCKS1 / ASNS轴并通过与miR-4768-3p完全结合来促进天冬酰胺的合成。
文献结论
①在本研究中，我们发现NUCKS1在骨肉瘤中发挥致癌作用，并通过上调ASNS的表达来促进天冬酰胺的合成。
②由NUCKS1高表达提高了ASNS或天冬酰胺的产生，促进了细胞的生长和转移。
③LINC00629通过完全结合miR-4768-3p来上调NUCKS1和ASNS的表达
④该文揭示了NUCKS1在骨肉瘤中的作用，并发现NUCKS1促进了骨肉瘤细胞的生长和转移。
本文研究结果强调了NUCKS1在调节天冬酰胺代谢中的作用，并揭示了LINC00629是NUCKS1的重要调控因子。为以后治疗骨肉瘤提供新的思路
文献涉及实验技术
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