往期我们介绍了蛋白质免疫印迹(Western Blot）相关实验结果分析知识点及实验操作。

往期回顾一：影响WB实验结果的因素综述

往期回顾二：聊一聊WB的一些事

往期回顾三：蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）实验操作

今天小编根据实验案例跟大家更加细致的讲解WB实验会出现的问题及解决方法。

1. 案例一

难点：内参一直跑不齐

解决过程：①根据灰度值计算进行多次内参调整；②重新制样；③更改上样量；④用指标膜再生内参 。依旧不齐。

原因分析：细胞样本不同，与抗体反应能力不同，因此内参会产生这种特殊情况，想要跑齐内参上样量将会差非常多，后续分析对应相应的内参即可。

总结反思：内参多次不齐后，思考是否是样本问题，找准原因，注意是否样本本身内参就无法跑齐，不要一味地浪费大量时间精力还有资源。

2. 案例二

难点：LC3B I/II（abcam ab48394）指标出现拥挤反白现象。

解决过程：经过重复实验，多次操作，讨论出现这种情况的几个原因：小分子指标（17,19KD）减少了电泳时间，电泳时间过短条带未跑开；样本有问题；电泳过程漏液。排除了这些问原因后问题依旧出现，增加了洗膜时间后曝光，这种现象消失。

总结反思：小分子指标曝光较难，曝光前可多洗洗，隔段时间曝光一次；注意控制电泳时间，防止小分子指标弥散。

3. 案例三

难点：小分子指标（11、13KDa），条带曝光不出来，或者效果不好。

解决过程：先后进行了减少电泳时间、更换0.22um的膜、增加洗膜时间等方法，效果依旧不理想，开始尝试配制18%浓度的胶，并进行冰水浴电泳防止小分子指标跑散。

总结反思：针对这么小的小分子指标，经验已经无法解决问题，需要我们进行尝试和摸索，根据具体案例具体调整分析，例如冰水浴电泳、更高浓度的胶。

问题1：配胶时，经常出现气泡或者絮状物杂质，还会出现脱胶问题

解决方法：

①采用保鲜膜包裹底座防止气泡产生；

②及时更换吸水纸；加琼脂少量快速，不要碰到梳子；

③不同的胶凝固时间根据温度条件灵活把控，比如15%或者18%的胶凝固快，可以缩短凝固时间到24min左右，或者减少TEMD的量；

④倒浓缩胶前晒干过程尽量不要倒扣，冰箱里保存时容器里放一些水。

问题2：曝光时，有时膜上杂质过多，小分子指标出现拥挤条反白条带

解决方法：

①目的条带充分跑开，小分子指标不要跑丢，小分子指标可适当缩短电泳时间，大分子量增加电泳时间；

②膜上较脏或者看不到目的条带的可增加曝光前TBST洗膜时间，尤其是小分子指标；

③封闭液摇匀，冰箱放置后使用上层液体，防止沉淀中杂志附着在膜上；

④磷酸化指标改用5%BSA封闭过夜。

问题3：电泳时漏样

解决方法：

①配胶要混均匀，玻璃板无杂质；

②加浓缩胶前放置时间久一点，确保无水乙醇充分挥发；

③提取蛋白时，离心后只吸上清，一定不要有沉淀，蛋白变性前再离心一次，以保证样本无干扰；

④组织样本上样前离心时间在半分钟以上，有效减少漏样问题。