1. 形态学标准

边缘光滑、完整。

无中心黑化、坏死或大空泡。

食管类器官：培养第9–14天出现角化珠，标志着进入最佳传代窗口。

肠道 / 胰腺类器官：出现分支状或 “菜花状” 结构提示成熟（该指征为参考项，非强制要求）。

神经类器官：需进行功能验证，例如β-III微管蛋白染色或电生理活性检测。

2. 功能与生长指标

日生长率降至5%以下，或培养基在48小时内变黄。

阳性细胞占比≥20%（例如肠道类器官中MUC2⁺杯状细胞）。

1. 试剂与耗材预冷

①基质胶：于4℃冰上过夜融化；避免反复冻融（冻融次数>2次可能导致胶强度下降30%以上）。

②耗材：移液枪头、离心管及PBS需在冰上预冷至少30分钟，防止基质胶提前聚合。

2. 去除基质胶

①吸除培养基。

②沿孔壁用预冷PBS轻柔洗涤2次。

③将板置于水平摇床上，以30rpm转速振荡30秒，彻底去除残留的胶碎片。

3. 解离处理

①机械解离（推荐用于脆弱的正常上皮类器官）：

用200μL枪头轻柔吹打5–10次；过100μm筛网。

②酶解法解离（适用于致密的肿瘤类器官）：

每孔加入200μL预冷的Accutase或TrypLE™酶。

室温孵育5–7分钟（致密肿瘤组织可适当延长时间）。

显微镜下监测，当边缘呈现 “起毛变亮” 状态时终止消化。

立即加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的预冷培养基终止反应。

4. 洗涤与离心

①将细胞悬液收集至15 mL离心管中

②于4℃条件下以200×g离心5分钟

③弃上清，用1mL预冷 PBS 重悬沉淀，再次离心以彻底去除残留 FBS

5. 重包埋与接种

①将细胞沉淀与基质胶按1:3（体积比）混合最终胶浓度需≥70%（浓度 < 60%常导致3D结构坍塌）。

②垂直滴加 20 μL 混合液至预热后的24孔板中央，形成液滴于37℃孵育15分钟使胶聚合沿孔壁轻柔加入500μL完全培养基

1. 碎片大小筛选

将机械解离后的碎片过100μm筛网。

弃去<50μm的小碎片（此类碎片的类器官形成效率仅为10–15%）。

2. 48 小时内请勿更换培养基

保留自分泌存活因子。

过早更换培养基会使重建效率降低约30%。

3. 清除气泡

胶内的气泡会导致100%的缺氧性坏死。

若出现>200μm的气泡，用10μL枪头轻柔移除。