
在类器官细胞培养物中加入相应试剂使类器官裂解,释放ATP,荧光素酶催化底物荧光素的转化,高效利用ATP的能量,发射光子形成光信号。发光强度与ATP在一定范围内成正比,而ATP又与活细胞数目又呈正比,因此可以对类器官活细胞数目进行定量检测。
类器官的准备 使用适合进行发光检测的24孔板,每孔接种类器官与基质胶混合物25ul平铺到孔底部,同时设置不含类器官的基质胶与培养液孔作为阴性对照,按照类器官培养的常规方法培养类器官。如有需要,可加入药物处理类器官。此外,如有必要也可以设置类器官的浓度梯度,以便后续确定试剂盒的使用效果。 试剂准备 2. 使用前轻柔颠倒几次使溶液混合均匀。 检测步骤 2. 加入与待测类器官培养物等体积并平衡至室温的缓冲液。例如,使用24孔培养板时,先去除类器官培养基,用类器官缓冲液置换静置清洗3次,然后吸取25μl本品加入25μl待测类器官培养物中(加入体积与基质胶团混合物体积一致);
3. 剧烈振荡5min使类器官充分裂解;室温放置25min以稳定发光信号,即可进行检测;
4. 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1s或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整;
5. 根据化学发光读数直接计算类器官的相对活力,或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出类器官细胞的相对活力。类器官在0-30个类器官/孔的类器官密度范围内有良好的线性关系,ATP标准品0-10,000nM浓度范围有良好的线性关系;