肿瘤缺氧微环境中galectin-3参与TAM促肿瘤的机制及galectin-3抑制剂靶向TAM抗乳腺癌转移作用的研究
影响因子：4.576
中科院SCI期刊分区：2 区
研究领域：医学-药学
浸润在肿瘤病变组织中的所有巨噬细胞统称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。肿瘤中TAM的大量存在往往与肿瘤转移、血管生成增加和预后不良有关。目前针对TAM的肿瘤治疗策略包括清除TAM和TAM的再极化己取得一定进展, 寻找出了多个靶点。但是针对这些靶点的策略缺乏特异性或存在严重的副作用，影响了进一步的临床研究和应用。因此，靶向TAM的治疗需要寻找新的特异性靶点。Galectin-3属于凝集素家族，对P-半乳糖苷具有高度的亲和力，参与了巨噬细胞多种生物学活动，如迁移、 凋亡、吞噬和粘附等。近年来研究表明，在肿瘤组织缺氧区域中Galectin-3高表达，而远离此区域的Galectin-3表达水平降低。TAM也常常在肿瘤的缺氧区域聚集，获得促肿瘤的特性。这提示肿瘤缺氧微环境中，Galectin-3有可能在TAM中表达并参与TAM的促肿瘤作用。那么通过靶向Galectin-3干扰缺氧区域中TAM的生存或功能，进而抑制肿瘤的发展，将会是很有潜力的治疗策略。
本论文旨在研究肿瘤缺氧微环境中，Galectin-3参与TAM促肿瘤作用的机制及Galectin-3抑制剂靶向TAM抗乳腺癌转移作用 。
1.采用体内以及体外实验考察肿瘤微环境对TAM中Galectin-3 表达的影响以及调节机制，并研究Galectin-3 在TAM中的促肿瘤迁移以及血管生成作用 。
2.采用体内以及体外实验评价Galectin-3 抑制剂改性柑橘果胶(MCP）对TAM的存活以及极化作用。
3.研究抗血管生成药贝伐单抗对乳腺癌组织缺氧以及TAM浸润的影响，采用体内模型评价联合应用MCP提高贝伐单抗抗肿瘤作用的效果和可行性。
实验细胞：人单核细胞系（THP-1）、 人乳腺癌细胞系 （MDA-MB-231)、和人脐静脉 内皮细胞（HUVECS), 荧光素酶标记的乳腺癌4T-1细胞 （ 4T1-luc 细 胞 ）
研究对象：采用人单核细胞系THP-1细胞经IL-4/IL-13诱导分化的M2型巨噬细胞以及人乳腺癌细胞系MDA-MB-231条件培养基(CM)诱导分化的乳腺癌相关巨噬细胞TAM为体外实验的研究对象，体内模型采用小鼠乳腺癌4T-1细胞原位接种模型 。
一、巨噬细胞的极化与鉴定
二、采用Transwell共培养以及CM共孵育的方法比较常氧与缺氧条件下M2和TAM对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、转移和血管形成的作用 。
三、通过建立化学缺氧模型以及物理缺氧模型观察Galectin-3在TAM中的蛋白表达、mRNA表达、分泌情况 。
① 采用低氧舱 (1%O2 )中培养细胞建立物理缺氧模型。
② 采用二亚硫酸钠(Na2S2O4 )建立化学缺氧模型
四、通过siRNA技术干扰Galectin-3的 表达研究Galectin-3是否参与 缺氧TAM的促肿瘤迁移、以及血管生成作用。
五、通过细胞培养基中外加重组人Galectin-3蛋白观察分泌出的Galectin-3对HUVECS外泌体的蛋白表达及促肿瘤细胞粘附、迁移功能的影响。
六、分别采用多种候选蛋白的抑制剂或激活剂研究缺氧环境下 Galectin-3在TAM中的表达调节机制。
七、采用BALA/C小鼠乳腺癌原位癌模型研究缺氧TAM与Galectin-3的关系 。
（1）M2型巨噬细胞分化实验
采用经典的M2型巨噬细胞的体外极化模型，用PMA/IL-4/IL-13 将人THP-1极化为M2型 。
（2）TAM细胞分化实验
采用人乳腺癌细胞MDA-MB-231条件培养基(CM)诱导THP-1极化为乳腺癌相关巨噬细胞 TAM。
（3）流式细胞术检测
M2细胞和TAM细胞表面抗原CD206、CD68的表达。
（4）细胞增殖实验
结果表明 ：缺氧与常氧比较，M2以及TAM的CM均明显促进了MDA-MB-231细胞的增殖 。
结果表明：在 MDA-MB-231 细胞与M2或TAM的Transwell共培养系统中，缺氧 M2和TAM明显促进MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭作用。
（6）体外血管生成实验
结果表明：缺氧与常氧比较，M2以及TAM的CM均明显促进了人脐静脉内皮细胞（HUVECS) 的血管形成。
结果显示：在这两种缺氧模型中，M2 或TAM的 Galectin-3蛋白表达增加。
（9）siRNA转染实验
为确定TAM细胞内以及分泌的 Galectin-3是否参与了TAM对乳腺癌细胞的迁移和侵袭作用，我们采用Galectin-3 siRNA(si Gal3)及Galectin-3抑 制 剂(β-乳糖) 分别抑制TAM细胞内和细胞外Galectin-3水平。通过Transwell将M2或TAM与MDA-MB-231细胞在缺氧环境下共培养。
结果显示： si Gal3 和 β-乳糖均显著抑制了M2或TAM所诱导的MDA-MB-231细 胞迁移和侵袭。
并且si Gal3 对 TAM促迁移和侵袭 的 抑制作用在常氧环境下明显弱于缺氧环境。
结果表明: 缺氧TAM胞内及胞外的Galectin-3参与TAM的促乳腺癌细胞迁移和侵袭作用 。
此外， 还研究了细胞内Galectin-3对缺氧条件下M2或TAM的存活和葡萄糖摄取的影响 。结果表明， 用si Gal3转染后 ，TAM在缺氧环境下的存活受到了抑制 ，并且在常氧以及缺氧环境下M2或TAM 对葡萄糖的摄取均受到了显著抑制。
结果显示：经过si Gal3或β-乳糖抑制细胞内或细胞外Galectin-3后，TAM诱导的 MDA-MB-231细胞的血管拟态和HUVECS的血管形成能力均显著减少。
此外，抑制细胞外Galectin-3的β-乳糖和抑制细胞内Galectin-3的si Gal3的联合作用比单独的β-乳糖或si Gal3更为明显 。
检测了外源性的Galectin-3对HUVECS外泌体的影响。首先，通过多种方法鉴定HUVECS是否产生和分泌外泌体。外泌体是一类直径50-150nm之间的囊泡样物质。
通过密度梯度离心从HUVECS的培养上清液中分离出外泌体。透射电镜观察。
结果显示：HUVECS的外泌体为预期的50-150nm直径形态。进一步通过WB方法检测并验证了己知外泌体标志物CD9和CD63在外泌体上明显表达 。
（11）外泌体荧光标记与MDA-MB-231细胞摄取外泌体实验
由于探究外泌体对细胞作用的前提是该外泌体可以被细胞所摄取 。因此下一步进行了外泌体体外的细胞摄取实验。将荧光标记的HUVECS外泌体与 MDA-MB-231细胞共孵育24h，通过荧光显微镜观察。
结果发现: 带有绿色荧光的外泌体被 MDA-MB-231细胞吞噬。
随后将收集的HUVECS来源的外泌体与乳腺癌细胞 MDA-MB-231共孵育。
结果显示：Galectin-3处理组的HUVECS外泌体可促进乳腺癌细胞的黏附和迁移。
（13）免疫荧光实验
免疫荧光实验以及PT-PCR的结果显示，Galectin-3可促进HUVECS中HIF-1α 的核转移以及ICAM-1的mRNA水平,而2DG的作用相反,提示 Galectin-3引起的糖酵解水平升高促进了HIF-1α 的核转移，最后导致了ICAM-1的表达增加。
（14）ROS（活性氧）检测实验
检测了ROS水平在缺氧TAM中Galectin-3表达调控机制中的作用 , 证实 了ROS是缺氧TAM中Galectin-3表达上调的关键调节因子。
NF-KB 是Galectin-3的转录因子之一 。接下来，检测ROS是否是通过转录因子NF-KB调 节Galectin-3的 表达 。免疫荧光结果显示，缺氧状态下TAM细胞核的NF-KB水平明显升高 。上述可抑制缺氧TAM中ROS生成 的抑制剂 （CC 、LY294002 、PDTC)均可降低缺氧TAM中的NF-KB的核转移。这些结果表明：Galectin-3在缺氧TAM中的表达上调依赖于缺氧诱导的ROS产生和下游的NF-KB核转移 。
（15）动物实验
4Tl-luc小鼠原位乳腺癌模型：将4Tl-luc 细胞按照5*105/只分别接种到20只BALA/C小 鼠的乳腺下的乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到100-200mm3 ，将肿瘤体积过大或过小的小鼠剔除 。将剩余的小鼠随机分为两组（ n=5 ）：
① 正常对照组 （ 常压饲养 ）
② 缺氧组（ 每天8%O2 环境下饲养6h ）
为了进一步验证缺氧与TAM中Galectin-3的关系，我们建立 了4Tl-luc 小鼠乳腺癌原位模型 。
小鼠每天8%O2 环境下饲养6h ( 缺氧组 ) 连续21天后，与正常饲养的小鼠（常氧组 ）相比，乳腺癌组织中CD68表达和Galectin-3表达均显著增加，表明缺氧可诱导肿瘤组织局部发生巨噬细胞浸润和Galectin-3 高表达。
此外，缺氧组小鼠肿瘤中CD31（血管内皮细胞标记物 ）的表达显著高于常氧组，表明缺氧促进肿瘤血管生成 。
每七天采用小动物活体成像仪观察小鼠肿瘤生长和转移情况 ，在腹腔内注射Ｄ-荧光素钾盐的 第9 min使用IVIS小动物活体成像系统对小鼠进行麻醉和成像。
活体成像系统结果显示 ，缺氧组小鼠中来自乳腺脂肪垫的4Tl-luc 细胞的转移显著高于常氧对照组。
研究总结：
①发现TAM中的Galectin-3不仅可通过分泌到细胞外直接影响乳腺癌细胞的侵袭转移及血管生成，还可以影响TAM的存活、细胞因子分泌间接影响肿瘤的发展 。
②课题发现在缺氧微环境下 ，Galectin-3的表达主要受TAM的ROS水平及下游的NF-kB核转移调节。
③课题发现MCP可通过抑制GLUT-1表达，减少TAM对葡萄糖的摄取，削弱了TAM在缺氧环境下的生存能力。
④发现抗血管生成药贝伐单抗可促进乳腺癌组织缺氧 、TAM的浸润以及Galectin-3的 表达，MCP可通过抑制Galectin-3，减少TAM浸润，协同贝伐单抗发挥抗乳腺癌增殖和转移作用 。
创新点：
①首次发现缺氧可促进TAM中Galectin-3的表达和分泌，并初步阐明Galectin-3在缺氧TAM促肿瘤功能中的作用及表达调节机制。本文的研究拓展了Galectin-3临床应用的理论依据，为基于TAM中Galectin-3为耙点的药物开发提供实验支持 。
②首次发现MCP可影响TAM的存活和恶性表型的分化，具有作为靶向缺氧TAM的药物开发价值 。
③首次发现MCP与贝伐单抗联合应用发挥抗肿瘤转移的作用。这一发现提示，在临床治疗中应用抗血管生成药治疗癌症时可靶向 Galectin-3减少肿瘤的转移 。
以上文献涉及的实验技术，均可在晶莱生物展开。
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