文献研究目标包括：

1.通过经典标志物（HT-II-280、前表面活性蛋白 C、板层小体）评估传代中关键 AT-II 相关特征的保留情况；

2.评估冻存可行性与类器官生物样本库构建潜力；

3.通过细胞外通量分析比较健康与纤维化 AT-II 类器官的代谢差异。我们假设纤维化 AT-II 细胞相较对照呈现更强糖酵解代谢，反映疾病相关代谢重编程。本研究通过提供明确、可转移的实验方案，建立可重复的人 AT-II 类器官培养框架，支持间质性肺病上皮功能障碍机制研究。

1.研究背景与意义

① 特发性肺纤维化（IPF）是致死性间质性肺病，预后差、无根治手段，急需能模拟人肺病变的体外模型。

② AT‑Ⅱ细胞是肺泡修复的关键干细胞，在纤维化中出现凋亡、衰老、异常分化及代谢重编程（向有氧糖酵解转换）。

③传统2D培养会快速导致AT‑Ⅱ去分化，现有类器官模型多依赖小鼠或iPSC，难以反映终末期患者原代细胞的真实表型与代谢特征。

2. 科学问题：能否建立稳定、可扩增、可冻存的人原代AT‑Ⅱ细胞3D类器官，并在该模型上重现纤维化相关的表型与代谢改变？

3.研究假设：纤维化来源的AT‑Ⅱ类器官会呈现更强的糖酵解代谢（Warburg样表型），反映疾病相关的能量重编程。

4.研究目标

①优化培养条件，稳定维持AT‑Ⅱ表型并抑制异常分化。

②验证冻存可行性，支持生物样本库。

③对比健康/纤维化类器官的代谢差异，验证疾病表型。

1：高纯度分离AT‑Ⅱ与AT‑Ⅰ细胞

核心结果：用HT‑II‑280磁珠分选从63例人肺组织成功分离出高纯度AT‑Ⅱ细胞（纯度≈84%双阳性），AT‑Ⅰ细胞纯度≈93%。

基于分选的分离流程示意图

B/C：分选后HT‑II‑280⁺/proSP‑C⁺双阳性细胞显著富集，远高于未分选组。

D：流式证实分选后HT‑II‑280强阳性。

E/F：同步可高纯度分离AT‑Ⅰ细胞（HT‑I‑56⁺）。

关键意义：为后续类器官提供了高纯度、高活力的起始细胞。

2：3D培养条件优化

核心结果：原1:1培养基/Matrigel比例会导致dome塌陷、细胞接触塑料而去分化为基底样细胞（KRT17⁺/CTSE⁺，丢失HT‑II‑280）。

优化为5:8培养基：Matrigel后，dome稳定，避免机械应力诱导的异常分化。

A：1:1比例出现细胞脱落、铺展、基底样转化；5:8比例保持正常肺泡球体形态。

B/C：基底样细胞丢失AT‑Ⅱ标志，但保留上皮标志并表达基底标志物。

关键意义：解决了原代AT‑Ⅱ体外易去分化的核心技术难题。

3：类器官形态与生长能力

核心结果：AT‑Ⅱ细胞高效形成肺泡球体（alveolospheres），形态多样（单囊/多囊/致密无腔），大小50–600μm。纤维化来源类器官集落形成率（CFR）显著更高，P0即达65.4%，健康组仅41.5%；P1均>90%。

A/B：14天内形成典型肺泡球体，可稳定传代至P3。

C：CFR在P0–P1显著上升，纤维化组全程高于健康组。

D–F：显微CT与H&E显示形态异质性，符合人肺泡结构特征。

关键意义：证明体系可稳定扩增，且纤维化细胞具有更强增殖能力。

4：AT‑Ⅱ表型稳定维持

核心结果：类器官持续表达AT‑Ⅱ关键标志：proSP‑C全程稳定（≈80%–90%阳性），HT‑II‑280略有下降但仍高表达。仅极少量向AT‑Ⅰ分化（HT‑I‑56⁺细胞<15%，P3）。超微结构见大量板层小体，证实成熟AT‑Ⅱ功能。

A–G：免疫荧光与流式证实proSP‑C稳定、HT‑II‑280轻度下降。

A–H：Lysotracker与TEM证实板层小体存在，为AT‑Ⅱ标志性结构。

关键意义：证明体系能长期维持AT‑Ⅱ干性与功能表型，不发生异常分化。

5：冻存后仍保持高活力与功能

核心结果：类器官经-150℃冻存≥28天，复苏后活力、集落形成、代谢活性无明显下降。凋亡与细胞毒性仅健康组轻微上升，纤维化组无显著变化。

A–E：AnnexinV、LDH、WST‑1、活死染色均证实冻存安全可靠。

关键意义：支持样本库建设与多中心复用，大幅提升实用性。

6：纤维化类器官呈现典型糖酵解重编程

核心结果（最关键发现）：

①IPF类器官基础糖酵解升高3倍，代偿性糖酵解升高3.5倍。

②ATP产量提升2.2倍，且主要来自糖酵解（IPF：77.9%；健康：42.9%）。

③氧化磷酸化无明显变化，呈典型Warburg样表型。

A.代表性代谢检测曲线

对培养12天的原代AT‑Ⅱ细胞（分别来自特发性肺纤维化、继发性纤维化或健康组织）进行细胞外酸化率（ECAR）及对应耗氧率（OCR）的代表性检测。本部分数据共纳入18例患者（7例癌旁对照组织、6例继发性纤维化组织、5例特发性肺纤维化组织），结果显示：特发性肺纤维化（IPF）来源的AT‑Ⅱ类器官基础糖酵解速率呈升高趋势（B），且代偿性糖酵解速率存在显著差异（C）。

B.基础糖酵解定量统计

采用单因素方差分析（F=4.954；*P=0.0233），后续行Tukey多重比较检验。组间差异：

对照组vs.特发性肺纤维化组：*P=0.0201（显著升高）

对照组vs.继发性纤维化组：P=0.7577（无统计学差异）

继发性纤维化组vs.特发性肺纤维化组：P=0.0852（无统计学差异）

C.代偿性糖酵解定量统计

采用单因素方差分析（F=5.905；*P=0.0128），后续行Tukey多重比较检验。组间差异：

对照组vs.特发性肺纤维化组：*P=0.0109（显著升高）

对照组vs.继发性纤维化组：P=0.6455（无统计学差异）

继发性纤维化组vs.特发性肺纤维化组：P=0.0679（无统计学差异）

D-E.ATP生成速率检测

为评估ATP生成速率，先向检测培养基中加入寡霉素，再加入鱼藤酮+抗霉素A（RotAA）进行检测。基于代表性ECAR与OCR数据（D），结合**总糖酵解ATP（glyoATP）与线粒体ATP（mitoATP）**生成量，计算总ATP生成速率（E）。图E展示了上述18例患者样本中，基础总ATP生成速率中糖酵解ATP与线粒体ATP的占比分布。

ATP生成量评估采用单因素方差分析（F=3.881；*P=0.401），后续行Tukey多重比较检验。组间差异：

对照组vs.特发性肺纤维化组：*P=0.0477（显著升高）

对照组vs.继发性纤维化组：P=0.1228（无统计学差异）

继发性纤维化组vs.特发性肺纤维化组：P=0.4473（无统计学差异）

F.细胞增殖活性验证

BrdU检测结果显示，细胞外通量实验后，类器官内AT‑Ⅱ细胞的增殖活性未出现显著下降。图中展示相对增殖率（%），计算公式为：（细胞外通量实验后450nm吸光度值/细胞外通量实验前450nm吸光度值）×100%。

关键意义：首次在人原代纤维化AT‑Ⅱ类器官中稳定重现疾病特异性代谢表型，可用于代谢靶点研究。

1.文献建立了国际上首个稳定、可标准化的人终末期纤维化肺原代AT‑Ⅱ细胞3D类器官培养体系，无血清、无滋养层、可冻存、可传代。

2.该体系能长期维持AT‑Ⅱ表型与板层小体功能，显著抑制向AT‑Ⅰ或异常基底样细胞分化。

3.纤维化来源AT‑Ⅱ类器官具有更强增殖能力，并稳定呈现疾病特异性有氧糖酵解重编程（Warburg效应），糖酵解ATP占比大幅升高。

4.该模型是研究肺纤维化上皮损伤、代谢异常、药物筛选的理想人源工具，支持精准医学与生物样本库应用。