1. 细菌活力检测

关键提示：培养基成分、氧浓度、类器官内的空间限制及细胞互作均可能影响共培养中细菌的生长。为明确共培养的动态变化，需定期检测活菌数量。

27.从培养体系中收集定量的类器官（如一个代表性穹窿），置于1mL冷DMEM中，转移至微量离心管。

28.3000g离心5分钟，弃上清。若为厌氧菌，此步需转移至无氧环境，且后续所有试剂均需无氧处理。

29.加入200µL0.5%皂苷溶液，孵育10分钟裂解类器官细胞，释放管腔与胞内的细菌。 

30.补加PBS至1mL，3000g离心5分钟，弃上清。

31.用PBS重悬细菌沉淀，进行系列梯度稀释。

32.取各稀释梯度的定量菌液涂布于相应琼脂平板上。

33.37℃过夜培养，根据菌落生长速度在3天内计数菌落。可计算得到每个类器官的活菌数，并与初始注射的细菌数（步骤14~21）进行比较。

2. 细菌身份鉴定

关键提示：可使用通用16S位点引物对357F/926R（375F：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；926R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′）扩增细菌16SrRNA的V3~V5区³⁷。

34.挑取单菌落，用PBS洗涤后弃上清。用10μLPBS重悬，取1μL直接加入PCR反应体系（总体系30μL）。加入4μL16S上下游引物（浓度均为5μM）。

执行16SPCR扩增，程序如下：

• 94℃预变性10分钟

• ［94℃变性1分钟，50℃退火30秒，72℃延伸30秒］×30个循环

• 72℃终延伸5分钟

• 4℃保温

35.（可选）针对革兰氏阳性菌，PCR扩增前可能需要酶法提取DNA。此时挑取单菌落，接种至相应液体培养基过夜培养。取1mL过夜培养菌液，13000g离心5分钟弃上清。按照试剂盒说明书提取DNA，再进行16SPCR扩增。

36.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭）分离，切下对应16S扩增子的条带（使用上述通用16S引物时产物为569bp），回收DNA。若PCR产物条带单一清晰，可直接纯化产物。

37.对DNA进行测序，鉴定细菌种类。

38.用1mL冰浴（4℃）DMEM收集培养的类器官，转移至15mL离心管，补加4℃DMEM至10mL。

39.300g离心5分钟，弃上清。

40.按照前述方法将类器官消化为单细胞悬液¹⁶（基础方案5）。

41.用含2µg/mLDAPI的DMEM重悬细胞，经细胞筛过滤后转移至流式管。

42.用分析型流式分选仪检测，通过DAPI阴性细胞占总细胞的比例计算细胞活力。

关键提示：可通过活细胞成像表征类器官-细菌共培养的互作过程（图a）。理想情况下，应使用不同的荧光染料分别标记上皮细胞与细菌。注射前细菌的荧光标记方法见步骤8。

43.向培养有BME包埋类器官的孔中加入荧光标记的细胞表面标志物抗体（如EpCAMAlexaFluor488抗体）。BME穹窿内的活细胞染色需使用较高浓度（1µg/mL）的抗体。

44.孵育2小时，使抗体充分渗透BME并标记上皮细胞表面。

45.采用荧光活细胞显微镜对共培养体系成像（示例见图b）。

关键提示：扫描电镜（SEM）可精细观察细胞表面的细菌分布形态（图c）。

46.将P1000吸头前端剪去，避免机械剪切类器官。

47.用1mL预冷的细胞回收液收集培养的类器官，转移至15mL离心管。

48.4℃条件下轻轻振荡孵育2小时，促进BME充分消化。

关键步骤：BME消化不充分会导致扫描电镜成像出现大量背景干扰。

49.补加冷DMEM至10mL。

50.300g离心5分钟，弃上清。

注意：从本步骤起，因涉及挥发性有毒试剂，所有操作需在化学通风橱内进行。

51.加入含1%戊二醛的PBS固定液，4℃固定过夜。

52.300g离心5分钟，用PBS重悬沉淀。

53.用剪口的P1000吸头将类器官转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，静置10分钟使类器官沉降贴附。

54.用移液器小心吸去上清。

55.将盖玻片置于12孔板中，类器官贴附面朝上。

56.进行样品梯度脱水：每孔加入1mL10%乙醇-PBS溶液，10分钟后吸去上清。

57.依次用25%、50%、75%、90%乙醇-PBS溶液，以及100%乙醇（2次）、50%六甲基二硅氮烷-乙醇溶液、100%六甲基二硅氮烷溶液进行梯度洗脱，每次更换溶液前吸去上一级液体。

58.将盖玻片置于化学通风橱中自然干燥过夜。

59.将盖玻片固定于样品台上，置于体视显微镜下进行后续操作。

60.为暴露注射细菌的类器官内部，在体视显微镜下用0.5mm钨针挑破类器官上壁（挑破后的类器官示例见图d）。

61.使用Q150R溅射镀膜仪，以20mA电流在样品表面镀1mm厚的金层。

62.进行扫描电镜成像（示例见图3e）。

类器官模型可在高度可控的实验条件下，同时检测宿主与微生物的基因表达变化，且可明确区分细胞来源。以下介绍人源与细菌RNA的收集及处理注意事项。

63.使用商用试剂盒（如QiagenRNeasy微量提取试剂盒或RNeasy细菌保护微量提取试剂盒）提取RNA。类器官-细菌共培养样品可直接用TRIzol或RLT裂解液裂解穹窿进行收集。

64.用无RNase的DNase处理样品，去除残留的DNA污染。

关键步骤：提取细菌RNA时，细菌细胞壁的充分裂解是保证提取产率的关键。其中，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌需要更充分的裂解。细菌样品因无内含子序列，难以区分基因组扩增与转录组扩增，因此需进行充分的DNase处理以去除基因组DNA污染。

关键提示：检测细菌对类器官的诱变效应，需首先使用克隆类器官系，暴露后进行第二轮克隆扩增。比较暴露前后克隆系的基因组，即可分析共培养过程中单个细胞发生的突变。

65.按照步骤22~26的方法向类器官注射细菌。

66.在不同起始MOI条件下共培养1~7天后，检测类器官细胞活力（步骤38~42），确定适用于检测基因毒性效应的共培养MOI与时长。活力轻度下降（下降幅度＞10%且＜50%）是长期共培养可接受基因毒性的良好指标。

67.根据步骤66确定的参数，按照步骤22~26的方法注射类器官。

68.共培养适宜时长后（通常为3天），加入100mg/mLPrimocin杀灭细菌。

69.让类器官从暴露应激中恢复4天。

关键步骤：共培养后过早传代可能导致类器官活力大幅下降。

70.传代类器官，继续培养至可再次注射的大小。

71.至少重复2次步骤68~71的操作，使突变充分累积。

72.按照前述方法用胰酶将类器官消化为单细胞悬液。

73.按100个细胞/µL的密度接种，用含10µMRho激酶抑制剂的扩增培养基培养。

74.类器官直径＞50µm后，挑取单个类器官并扩增为新的类器官系。

75.类器官系成功扩增后，收集一孔长满的12孔板类器官，使用商用试剂盒提取DNA。

76.按照前述方法，通过全基因组测序分析细菌暴露前后克隆类器官的DNA变化（“全基因组测序与读段比对”及后续章节）。

77.取步骤1~3制备的类器官，用冷DMEM收集，300g离心5分钟弃上清。

关键步骤：可采用显微注射、培养基加毒等不同暴露途径，分别实现顶端或基底侧特异性感染。本文所述的机械剪切方案可使病毒同时接触顶端与基底侧，根据我们的经验感染效率最高。

78.在1mLDMEM中用窄口玻璃巴氏吸管吹打，破碎囊状类器官。若感染分化后的类器官，可加入TrypLE37℃短暂孵育1~2分钟，辅助破碎上皮层。

79.300g离心5分钟，弃上清。

80.用冷DMEM洗涤类器官1次。

81.融化病毒储液，稀释至适宜MOI（MOI计算见步骤10~21）。剪切类器官的病毒感染，使用每个穹窿的总细胞数计算MOI（见步骤11和12），而非注射的类器官数量。

82.根据所需细胞类型，用扩增或分化培养基稀释病毒，重悬类器官片段（每12孔板收集的类器官用100µL稀释病毒液重悬）。

83.37℃、5%CO₂条件下孵育2小时。

84.用冷DMEM洗涤2次，去除未结合的病毒。

85.充分重悬于BME中，按每穹窿约15µL的量接种。

可选步骤：若需延长病毒暴露时间，可在步骤85接种前将病毒加入BME中。

86.置于37℃CO₂培养箱中，倒置孵育10~20分钟使BME凝固。

87.每孔加入1mL类器官扩增或分化培养基，置于培养箱中培养至目标共培养时长。