流式细胞术可以在单细胞水平上分析细胞表型和群体比例，是免疫分型、细胞功能研究、肿瘤微环境分析和药效评价中常用的检测方法。

但流式实验能不能得到稳定结果，很多时候并不取决于“上机那一刻”，而取决于更前面的步骤：样本是否新鲜、细胞是否分散、活率是否合格、红细胞是否处理干净、抗体染色是否充分、上机前是否再次过滤。

这篇文章主要整理流式细胞术中最基础、也最容易被忽略的一部分：样本制备与表面抗体染色。

流式实验开始前，建议先明确以下几点：

1. 不同样本的处理方式不同，常见样本包括：

· 悬浮细胞；

· 贴壁细胞；

· 外周血；

· 脾脏、淋巴结、骨髓；

· 肿瘤组织；

· 肺、肠道、肝脏等实体组织。

悬浮细胞处理相对简单；贴壁细胞需要考虑解离方式；组织样本则要重点控制消化时间、碎片和细胞活率。

2. 检测目标：

本文章主要围绕表面Marker检测，如果涉及胞内因子、核内转录因子或磷酸化蛋白，需要额外设计固定/破膜流程，不建议直接套用表面染色Protocol。

3. 上机需要提前确认：

· 仪器通道是否支持所选荧光；

· 是否需要活死染；

· 是否需要Fc Block；

· 是否准备好补偿管；

· 样本量是否足够正式样本和对照管。

1. 新鲜组织样本

新鲜组织一般建议采样后尽量在1小时内进入处理流程；如果不能立即处理，应放入合适的预冷缓冲液中低温暂存，并记录放置时间。

不建议组织样本长时间室温放置，放置时间过久会增加细胞死亡、抗原变化和背景升高风险。

2. 血液样本需确认：

· 抗凝管类型；

· 采血时间；

· 是否凝血；

· 是否严重溶血；

· 样本编号和分组是否清楚。

明显凝血或严重溶血的样本，会影响后续细胞回收和结果判断，需要谨慎处理。

3. 培养细胞样本在处理前需确认：

· 细胞状态是否良好；

· 是否污染；

· 是否过度融合；

· 是否经过药物处理；

· 是否需要同时收集贴壁细胞和悬浮细胞。

对于凋亡、损伤或药物处理实验，培养上清中的悬浮细胞可能包含重要信息，不建议直接丢弃。

流式检测的基础是单细胞悬液，目标不是“细胞越碎越好”，而是尽量获得：分散均一、团块少、碎片少、活率可控的细胞悬液。

1. 悬浮细胞参考流程：

1. 收集细胞悬液；

2. 轻柔混匀；

3. 取样计数；

4. 300–500×g离心5 min；

5. 弃上清；

6. 用预冷染色缓冲液重悬；

7. 显微镜下观察团块和碎片。

对于脆弱细胞，可适当降低离心力，减少机械损伤。

2. 贴壁细胞参考流程：

1. 弃去培养基；

2. PBS轻洗；

3. 加入合适的消化液或无酶解离液；

4. 细胞脱落后及时终止；

5. 收集细胞悬液；

6. 轻柔吹打；

7. 离心洗涤；

8. 计数并检测活率。

如果检测表面Marker，不建议默认长时间强胰酶消化，部分表面抗原可能受消化影响，可根据目标Marker选择EDTA、无酶解离液或更温和的处理方式。

3. 组织样本通常需要机械剪碎和酶消化，可参考流程：

1. 新鲜组织置于预冷缓冲液；

2. 去除明显坏死、脂肪或结缔组织；

3. 剪成约1 mm³小块；

4. 加入合适酶消化体系；

5. 37℃温和消化；

6. 中间轻柔吹打；

7. 终止消化；

8. 70 μm滤网过滤；

9. 按需红细胞裂解；

10. 洗涤、计数、检测活率。

组织样本不建议一次性强消化过久，消化不足会导致团块多、堵管风险高；消化过度会导致细胞死亡、抗原丢失和群体比例改变。

1. 过滤

过滤可以减少团块，降低堵管风险，常用方式：

· 组织消化后初筛：70 μm滤网；

· 上机前终筛：40 μm滤网。

如果滤网堵塞，不建议用力挤压组织块通过滤网，应更换滤网或重新处理样本。

2. 红细胞裂解

血液、脾脏、肺、肝脏和肿瘤组织样本中，常见红细胞残留。

需要裂解时，应按裂解液说明书控制时间，人全血、小鼠脾脏、肿瘤组织中的红细胞量和细胞耐受性不同，裂解时间不能一刀切。

操作原则：

（1）加入裂解液；

（2）轻柔混匀；

（3）控制裂解时间；

（4）到时间后立即终止；

（5）离心洗涤；

（6）重新计数并观察细胞状态。

裂解过度会影响目标细胞活率，因此不要为了“颜色完全变清”而无限延长裂解时间。

3. 洗涤

常规洗涤可参考400–600×g离心5 min，如果细胞较脆弱，可适当降低离心条件；每次弃上清时注意不要吸走细胞沉淀。

1. 染色前必须计数，需要记录：

· 总细胞数；

· 活细胞数；

· 活率；

· 细胞浓度；

· 是否有团块；

· 是否有大量碎片。

2. 推荐参考：

常规表面染色可按每管约1×10⁶ cells / 100 μL染色体系作为起始参考。

如果目标细胞稀有，可适当增加起始细胞数；如果样本珍贵，也可根据抗体说明书和仪器要求调整。

3. 不同实验的活率要求不同，一般建议：

· 常规表型分析：活率尽量≥80%；

· 多色Panel、稀有群体分析：尽量≥85%–90%；

· 活率明显偏低的样本，应在结果解释中标注。

死细胞容易非特异吸附抗体，是流式背景高的重要来源。

建议使用活死染的情况包括：

· 组织消化样本；

· 肿瘤组织样本；

· 药物处理后细胞；

· 冻存复苏细胞；

· 活率不稳定样本；

· 多色流式实验。

操作要点：

1. 细胞洗涤后重悬；

2. 加入活死染工作液；

3. 按说明书避光孵育；

4. 洗涤去除多余染料；

5. 进入表面染色。

如果使用固定型活死染，通常建议在固定前完成，同时，活死染也需要设置单染补偿对照。

免疫细胞、肿瘤组织、脾脏、淋巴结、骨髓等样本中，部分细胞表达Fc受体，容易造成非特异性抗体结合。

建议考虑Fc Block的样本包括：

· 小鼠免疫细胞；

· 脾脏；

· 淋巴结；

· 骨髓；

· 肿瘤组织免疫浸润分析；

· 巨噬细胞、单核细胞、粒细胞较多的样本；

· 背景染色偏高的样本。

操作流程：

1. 细胞重悬于染色缓冲液；

2. 加入Fc Block；

3. 4℃或冰上孵育10–15 min；

4. 不洗涤或按说明书处理；

5. 加入表面抗体混合液。

表面染色一般在固定/破膜前完成，推荐流程：

1. 调整细胞浓度；

2. 每管加入约1×10⁶细胞；

3. 300–500×g离心5 min，弃上清；

4. 加入Fc Block，冰上或4℃孵育10–15 min；

5. 加入表面抗体混合液；

6. 2–8℃或冰上避光孵育15–30 min；

7. 加入染色缓冲液洗涤；

8. 400–600×g离心5 min；

9. 弃上清；

10. 重复洗涤1次；

11. 用适量染色缓冲液重悬；

12. 上机检测。

为什么建议低温避光？

低温可以降低细胞代谢活性，减少部分抗体内吞、受体重排和非特异结合风险；避光可以减少荧光淬灭，帮助保持信号稳定。

注意事项：

· 抗体使用量应做滴度优化；

· 同批样本细胞数尽量一致；

· 抗体混合液建议提前配好；

· 不建议抗体过量使用；

· 染色过程中避免反复剧烈吹打；

· 染色结束后尽快上机检测。

正式上机前，建议逐项确认：

· 样本是否为均一单细胞悬液；

· 是否有明显团块；

· 是否通过40 μm滤网；

· 细胞浓度是否合适；

· 细胞活率是否满足要求；

· 活死染是否完成；

· Fc Block是否按需使用；

· 表面抗体是否避光孵育；

· 洗涤是否充分；

· 单染补偿管是否齐全；

· 样本编号是否清楚；

· 上机顺序是否记录。

如果样本静置时间较长，上机前需要轻柔混匀，不要剧烈涡旋，以免增加碎片或损伤细胞。

1. 上机堵管

可能原因：

· 细胞团块多；

· 过滤不充分；

· 细胞浓度过高；

· 死细胞多；

· 组织消化不充分。

建议：

· 上机前40 μm过滤；

· 降低细胞浓度；

· 优化组织消化；

· 减少样本放置时间；

· 必要时重新制备单细胞悬液。

2. 背景高

可能原因：

· 死细胞比例高；

· Fc受体非特异结合；

· 抗体浓度过高；

· 洗涤不充分；

· 碎片较多；

· 样本放置时间过长。

建议：

· 加入活死染；

· 使用Fc Block；

· 做抗体滴度优化；

· 增加洗涤；

· 优化样本制备；

· 对关键Marker设置FMO。

3. 信号弱

可能原因：

· 抗体不适配流式；

· 表面抗原被消化影响；

· 抗体浓度不足；

· 目标表达量低；

· 荧光选择不合适。

建议：

· 核对抗体应用类型；

· 优化细胞解离方式；

· 设置阳性对照；

· 调整抗体滴度；

· 对低表达Marker选择更亮荧光。

4. 细胞回收率低

可能原因：

· 洗涤次数过多；

· 离心条件不合适；

· 弃上清时吸走细胞；

· 样本起始量不足；

· 过滤过程损失较大。

建议：

· 减少不必要洗涤；

· 优化离心条件；

· 弃上清时保留少量液体；

· 对稀有群体增加起始细胞数；

· 根据细胞大小选择合适滤网。

流式细胞术的基础，不是上机分析，而是样本制备和染色质量。

一份合格的流式样本，应尽量做到：

· 单细胞悬液均一；

· 团块少；

· 碎片少；

· 活率可控；

· 红细胞残留少；

· 表面抗原尽量保留；

· 染色条件一致；

· 上机前检查完整。