RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer

RBFOX2调节胰腺癌中选择性剪接的转移特征

期刊：Nature         

发表时间：2023-03-22    

影响因子：69.504

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma ，PDA）——疾病背景

PDA是一种具有局部侵袭性及转移性扩散的高致死性肿瘤，虽然已经有4个关键的致癌基因被发现了（KRAS、SMAD4、CDKN2A和TP53），但是它们都在PDA进展中保守，没有关于它们突变对PDA转移进展的报道。到目前为止，与PDA转移扩散相关的基因突变还没有被发现，且选择性剪接和剪接因子在PDA中发挥作用的报道很少。

可变剪接(或选择性剪接， alternative splicing，AS)

有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。

1. PDA（胰腺导管腺癌）的AS（可变剪接）事件整体情况

a. 对395个PDA患者的RNA测序数据进行AS事件的分析，发现了两个集群：61%的原发性胰腺肿瘤属于cluster 1，71%的转移性肿瘤属于cluster 2；

b. 在原发组和转移组之间鉴定了约8000个显著差异的剪接事件，前20个剪接事件足以将PDA患者样本分为与临床分期高度相关的两组；

c. 参与细胞骨架组装和迁移的RHO GTPase通路基因富集。

1.2 RBFOX2基序的富集

d. 对RHO通路基因的差异剪接事件进行从头基序分析：5 '剪接位点上游最丰富的基序与RBFOX2结合序列具有高度同源性；

e-g. PDX衍生的转移性患者样本中，剪接因子RBFOX2的蛋白水平低于原发肿瘤样本，而mRNA水平没有明显差异。

（PDA患者衍生的异种移植瘤裸鼠模型）

2. RBFOX2在胰腺癌进展中作为转移性肿瘤抑制因子

a. 蛋白免疫印迹检测过表达和敲除RBFOX2；

b. X50细胞伤口愈合实验；

c. X50细胞克隆形成实验；

d. 用RBFOX2 cDNA mCherry标记的X50 PDX细胞静脉注射到裸鼠体内，肺转移瘤显著减少。

RBFOX2的过表达抑制PDA细胞的转移潜力。

e. BxPC3原代PDA细胞伤口愈合实验

f. BxPC3克隆形成实验

g. 将GFP标记的RBFOX2敲除的BxPC3原代PDA细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠体内

h. 用 EIJ sgRNA处理的BxPC3细胞具有与RBFOX2基因敲除细胞类似的表型

i. 将RBFOX2的cDNA引入EIJ细胞可挽救其表型

RBFOX2缺失会导致肺转移能力增强：设计一种针对RBFOX2中外显子-内含子交界处的sgRNA（RBFOX2 EIJ sgRNA），从而只沉默内源性的RBFOX2。

j.  在RBFOX2 EIJ sgRNA的BxPC3原代PDA细胞和X50转移性PDA细胞中过表达RBFOX2ΔRRM，无法挽救表型；

k-l. BxPC3伤口愈合、克隆形成实验；

m-n. X50伤口愈合、克隆形成实验。

RBFOX2的RRM对其在PDA进展中的肿瘤抑制活性是必不可少的。

3.1 RBFOX2介导局灶黏附

a-b. RNA测序及生信分析：114个RBFOX2依赖的交替剪接事件，这些事件相互调节

c. 87个RBFOX2调控的基因在RHO GTPase (RHOA、CDC42和RAC1)通路上的富集

为确定调节PDA细胞转移过程中，RBFOX2的剪接目标

MXE：mutually exclusive exons (外显子互斥7%)

互斥可变剪接：基因组上串联排列着2个或2个以上相邻可变外显子，有且只有一个可变外显子经过剪接进入到同一个成熟mRNA分子中。互斥外显子的长度相同或者相差3的整倍数

IR：intron retention内含子保留，进一步支持了RBFOX2在PDA中作为转移性肿瘤抑制因子的生物学作用

RHO通路调控肌动蛋白细胞骨架的组装，而粘着斑的形成需要细胞骨架的重排，在细胞迁移过程中需要形成新的粘着斑（一种将细胞与细胞外机制进行连接的亚细胞结构），增强粘着斑形成会促进肿瘤转移。

3.2 RHO GTPase途径的抑制作用

d-f. 对RBFOX2缺失的BxPC3细胞进行MBQ167干预可抑制其迁移率，但体外的存活率或增殖率没有变化；

g-h. 对静脉注射GFP标记的RBFOX2耗尽的BxPC3细胞的小鼠体内给予MBQ167，可抑制肺部转移。

抑制RHO通路可以抑制肿瘤细胞转移。

4. MPRIP剪接调节胰腺肿瘤细胞的转移潜能

a-b. 敲除RBFOX2会导致MPRIP第23个外显子被跳过（外显子跳跃），而过表达RBFOX2会导致该外显子不被跳过（外显子包含）；

c. 与原发肿瘤相比，转移性PDA样本中MPRIP 23号外显子跳跃异构体的数量较高（PSI较低）；

d. MPRIP低组的患者生存结果更差。

e. 诱导23号外显子跳跃异构体：设计了针对第23外显子的3′或5′剪接位点的sgRNAs，都能有效触发23号外显子跳转

f-g. 表达sgRNAs的BxPC3原代肿瘤细胞在软琼脂中表现出更强的迁移、克隆形成能力

h. 将GFP标记的BxPC3原发肿瘤细胞（3′或5′剪接位点sgRNAs）静脉注射到NOD-SCID小鼠体内，与对照细胞相比，肺转移灶的数量明显增加

接下来测试MPRIP剪接的调控是否会影响PDA肿瘤细胞系的转移潜力，将GFP标记的BxPC3原发肿瘤细胞用3′或5′剪接位点sgRNAs静脉注射到NOD-SCID小鼠体内，与对照细胞相比，肺转移灶的数量明显增加。

i. 设计sgRNA导致23号外显子的包含

j-k. 携带靶向RBFOX2基序的sgRNA（DS-24 MPRIP sgRNA）的X50转移细胞迁移能力、克隆形成能力明显降低

l. MPRIP外显子23保留异构体的转移的X50细胞，抑制了肺转移潜力

RBFOX2调控的PDA进展与MPRIP 23号外显子跳跃异构体有关。

本研究发现：

差异剪接事件与PDA进展程度相关，并鉴定到剪接因子RBFOX2参与其中，过表达RBFOX2可以降低癌细胞转移能力，而敲除RBFOX2可以增强癌细胞转移能力，说明RBFOX2是一个PDA的转移抑制因子，并发现RBFOX2的靶基因参与RHO GTPase通路，调控细胞骨架组装和粘着斑形成，且RBFOX2的靶基因MPRIP与PDA转移相关。

通路机制：

RBFOX2通过可变剪切调控下游基因MPRIP的表达，靶向RHO GTPase通路，从而影响胰腺癌的转移。

创新点：

1. 利用已发表的数据进行分析

作者对已发表的395个PDA患者样本的RNA测序数据库进行分析，根据可变剪接谱而不是基因表达谱对样本进行分类，说明剪接变化与PDA的进展相关。

2. 为临床治疗转移性胰腺癌提供了新思路

发现了RNA剪接与PDA转移之间的关系，揭示了RBFOX2作为PDA肿瘤抑制因子的功能和机制，为未来治疗转移性PDA提供新的思路和理论基础。