【5分钟讲透实验】细胞迁移实验影响因素汇总

往期我们讲了关于细胞迁移实验的注意事项、常见问题及解决方法，本期一起来学习：

什么是细胞侵袭！

细胞侵袭常见问题及解决方法！

如何辨别细胞迁移和细胞侵袭！

细胞侵袭是指研究细胞穿透和侵入到周围或对立体组织的能力的实验。这是一种重要的生物学过程，在胚胎发育、组织修复和疾病转移等生理和病理过程中发挥着关键作用。

1.侵袭性细胞需要通过细胞外基质附着和黏附来稳定在特定位置。

2.细胞释放出特殊的酶类（如金属蛋白酶和蛋白酶等），以降解周围的基质分子，如胶原蛋白和纤维连接蛋白等。这样一来，细胞就能够通过基质间隙进行运动，并侵入新的领域。

3.细胞侵袭还涉及到细胞内信号传导网络的激活和调节。如细胞外刺激激活的受体、下游的蛋白激酶级联反应等。这些信号通路可改变细胞形态，增强细胞运动性，促进细胞的侵袭能力。

4.细胞侵袭在生理上发挥重要作用，比如胚胎发育过程中的胚胎内胚叶的形成，以及组织修复和再生过程中的细胞迁移。

5.异常的细胞侵袭也与一些疾病相关，尤其是癌症的转移过程。癌症细胞通过侵袭和穿越血管和淋巴管壁，进入血液循环或淋巴系统，从而扩散到身体的其他部位，并形成远处的转移灶。

细胞侵袭实验是一项复杂和精细的实验，在实验过程中应严格按照实验步骤进行操作，并及时记录和分析实验数据，以保证实验结果的准确性和可靠性。

1. 显微观察

通过显微镜观察细胞的形态变化和运动方式，可以初步判断细胞是否在进行迁移或侵袭。细胞迁移通常表现为单个或集群细胞的方向性移动，而细胞侵袭则可能伴随细胞的形态变化和基质附着。

细胞侵袭的细胞通常会改变其形态，伸出伪足或突起，穿过基底膜等。相比之下，迁移细胞通常会保持其形态并沿着基质表面移动。

2. Transwell迁移和侵袭实验

采用Transwell腔室（Transwell chamber）来模拟细胞穿过孔隙或基底膜的过程。迁移实验利用无孔或小孔的Transwell膜来观察细胞通过膜的能力，而侵袭实验则使用具有基质涂层的Transwell膜来模拟基质降解和穿透的过程。这些实验可以定量测量细胞的迁移和侵袭能力，并进行比较分析。

3. Scratch划痕实验

通过在细胞培养皿中划一直线伤口（scratch），观察细胞填补伤口的速度和方式。如果细胞仅仅是向前迁移填补伤口，那么这是一个迁移行为；而如果细胞还伴随着形态变化并穿透周围基质，那么就是一种侵袭行为。

4. 分子标记方法

利用特定的抗体或荧光探针，可以标记细胞迁移和侵袭相关的蛋白，如细胞黏附分子、细胞骨架蛋白和信号传导分子等。通过观察这些标记物的分布和变化，可以了解细胞的迁移和侵袭状态。

5. 基因表达

侵袭和迁移细胞的基因表达也不同。侵袭细胞通常表达蛋白酶、转录调节因子等，而迁移细胞则表达细胞黏附蛋白和细胞迁移相关的信号分子等。

6. 细胞信号通路

细胞侵袭和迁移所需的细胞信号通路不同。侵袭细胞需要激活蛋白酶、重排细胞骨架等来穿过基底膜。而迁移细胞通常需要适应新的环境和生长条件来维持其生长。

研究细胞迁移和侵袭相关的信号通路（如Rho家族GTP酶、PI3K/AKT和MAPK等）和相关蛋白（如FAK、ROCK等），通过检测其表达和激活状态，可以揭示细胞行为的差异。

细胞迁移和侵袭是连续的谱系，没有明确的分界线。因此，在鉴别细胞迁移和侵袭时，应结合多种方法综合考虑，避免仅依赖单个指标或实验结果做出判断。

以肺癌细胞为例，对Transwell检测细胞侵袭能力中常遇到的部分细节问题进行分析，对实验中的影响因素提出应对策略，给予相应解决方案。

1. 肿瘤细胞侵袭迁移试验中细胞接种过程中的影响因素

1.1接种细胞

① 侵袭/迁移能力弱的细胞在铺板前可以撤去血清饥饿12～24h。

② 细胞计数时一定要尽量严格，以保证各孔细胞密度均匀，为了避免各孔间由于细胞计数引入的误差，一般需要重复三个副孔。

③ 种细胞时尽量从孔的中间位置滴加，力度柔和，速度尽量慢，以免冲击力太大破坏胶面;同时避免气泡产生。

1.2 注意Transwell小室底部气泡的产生

Transwell小室在放入孔板时，常常会因为液体表面张力的原因在小室底部形成气泡，气泡导致的底部液面不均会严重影响细胞侵袭和迁移能力，因此在放置小室时，应轻柔匀速，若发现底部产生气泡，不要拍打板子(这样做会使刚铺好的细胞重新聚团)，而应将小室轻轻提起，重新放置直至无气泡。

2. 肿瘤细胞侵袭实验中细胞染色过程中的影响因素

2.1棉签擦拭Transwell小室内部的方法

过大或过小的棉签都不利于擦拭小室底部，尤其是棉花较为松散的医用棉签，掉落的纤维会影响实验结果的可读性，应该选用大小适中较为紧实的棉签，使用前稍微沾湿，沿一个方向(如顺时针)从边缘向中心捻动棉签进行擦拭，擦拭完立即换一根新的棉签重复上述步骤，不应一根棉签反复擦拭。直至镜下观测到确已将凝胶及未迁移的细胞团擦拭干净。

2.2 结晶紫染色及漂洗时间

在结晶紫染色前，应将小室内外PBS稍吸干，令小室底面细胞稍干(水分风干即止)，再进行染色，效果较好。染色及PBS漂洗时间应根据实验情况多加摸索，确定最佳的染色及脱色时间。理想的染色结果是细胞均匀着色，形态整齐，Transwell小室膜背景干净，能清楚地看到微孔。染色后将小室稍风干，置于滴加了甘油封片剂的载玻片上，倒置显微镜下观测;也可将底部膜用手术刀片仔细分离，置于正置显微镜下观测，效果更好(但使用此方法后，Transwell小室将不能回收再利用)。

3. 问题分析

3.1穿膜细胞过多可能的原因

① 细胞铺板数量过多，应做梯度接种预实验确定合适的细胞接种数。

② 细胞过多导致无法计数时的解决方案:

如穿膜细胞过多无法计数，在染色后可用33%醋酸脱色，洗脱结晶紫在酶标仪上590nm处测定其OD值，可间接反映细胞数，避免样本浪费，但如若需要实验图片，仍需重复试验。

3.2穿膜细胞太少可能的原因

① 需考虑细胞的侵袭能力。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)属于基质金属蛋白酶家族，几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。如果多次重复试验均未见细胞侵袭结果，可以检测一下该细胞株基质金属蛋白酶MMPs的表达情况。

② 细胞接种数量过少，应做梯度接种预实验确定合适的细胞接种数。

③ 穿膜细胞由于粘附贴壁能力不强，落到下室孔板培养液中，可以在膜下表面涂纤维粘连蛋白(FN)增加细胞贴壁性能及趋化能力。

④ 小室放入孔板中时，下部带有气泡，导致趋化作用消失，细胞无法穿膜。

⑤ Transwell小室孔径的选择需要重新确认。Transwell小室底部的通透性支持物(膜)存在不同材料制成及不同孔径大小，应根据实验具体要求选择不同的系统。

3.3穿膜细胞不均匀可能的原因

① 基质胶在操作过程中由于器材或环境温度过高导致的提前凝聚，会使胶面不平整，细胞聚团。

② 接种过程中，细胞悬液应匀速轻柔滴加至孔中央，并避免因孔板震动导致的细胞聚团(24孔板)，或进行“十字”摇动使细胞均匀(6孔板)。